Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов

• Автор: Забережный, Алексей Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 259 с. : ил.

К ним относятся 1 изучение регуляторных последовательностей вирусного генома и 2 изучение факторов регуляции, синтез которых осуществляется i при одновременном заражении вирусомпомощником или введении экспрессирующих векторов. В практическом отношении такие эксперименты приводят к изучению механизмов аттенуации и к получению новых аттенуированных штаммов. Для изучения факторов вирусной репродукции, например, репликативного комплекса, последовательность минигеномов оставляют неизменной, но заменяют вирусыпомощники, например, вирулентный на аттенуированный. Изменение уровня репликации или экспрессии репортерного гена в минигеноме в данном случае означает связь факторов репликазного комплекса с вирулентностью. Для более глубокого изучения факторов репликации и транскрипции сегодня возможно отказаться от вирусапомощника. Происходит репликация минигенома и экспрессия генарепортера. В этом случае каждая из плазмид может быть подвергнута генетическим манипуляциям, что создает неограниченную возможность изменять аминокислотную последовательность факторов репликации и транскрипции и оценивать их функции в прямых экспериментах. Каждое сделанное наблюдение относительно связи структуры РНК или белков с фенотипическими особенностями вируса может быть немедленно подтверждено в опытах по введению комплементирующих мутаций в минигеном или в белки репликазного комплекса. Рассмотрим более сложную модель минигенома, содержащую два репортерных гена двухцистронный минигеном. ШС
Как видно из схемы, вслед за геном следует репортерный ген люциферазы . Между ними встроена последовательность РНК так же, как два соседних вирусных гена связаны в геноме. Подобная организация минигенома позволяет исследовать относительную экспрессию каждых двух соседних вирусных генов в зависимости от всех упомянутых выше факторов, а также от структуры межгенного участка. В следующих разделах будут подробно описаны опыты с минигеномами на основе вируса и других пнсвмовирусов. Например, было изучено влияние репликазных комплексов одних представителей пневмовирусов на регуляторные области геномов других в опытах с двумя пневмовирусами РСвирусом человека и пневмовирусом птиц V 9. Промоторы РСвируса, которые определяют репликацию и транскрипцию вирусной РНК, были проанализированы в экспериментах с минирепликоном, содержащим основные элементы генома . При помощи минигенома вируса была установлена роль последних 7 нуклеотидов в 5концевой области терминальной трайлерной последовательности геномной цепи РНК 9, что дало возможность подтвердить гипотезу о вовлеченности различных полимеразных механизмов в процессы репликации и транскрипции РСвирусов. Технология минигеномов была активно использована при изучении РСвирусов, благодаря усилиям лаборатории Питера Коллинза из I Национальный Институт Здоровья, США. Данный вирус является объектом исследований и в настоящей работе. Поэтому прежде чем переходить к описанию применения методов обратной генетики в отношении РСвируса, следует подробнее остановиться на его основных характеристиках. ВИРУС. Респираторносинцитиальный вирус РСвирус, ЯБУ относится к семейству Рагатухоутс1ае, отряду Мопопеау1га1ез, и является одним из основных возбудителей вирусных респираторных инфекций у детей раннего возраста. РСвирус человека вызывает серьезные заболевания нижнего респираторного тракта, включая бронхит и пневмонию у детей и младенцев. Инфекция широко распространена в мире. Она особенно опасна для пожилых людей и страдающих иммунодефицитом . РСвирусы подразделяют на 2 антигенные группы А и В 5. Внутри групп выделяют различные подгруппы на основе особенностей антигенной структуры. Наиболее вариабельным в антигенном и генетическом отношении является оболочечный гликопротеин в. При этом от года к году случаются эпидемии, которые вызваны преимущественно вирусами, относящимся к одной группе, или А или В. Антигенные различия, найденные между РСвирусами групп А и В, оказывают влияние на существующие стратегии создания противовирусных вакцин, т. РСвирус представляет собой оболочечный вирус, геном его представлен одной молекулой одноцепочечной РНК отрицательной полярности, которая тесно ассоциирована с белками вириона в нуклеокапсидной сердцевине рис. Рис.