Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции

• Автор: Амосова, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. АДЕНОВИРУСЫ, ИХ ОБЩАЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА, ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ. ПРОТИВОАДЕНОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение вирионов АВ

1.2. Структурные белки аденовирусов

1.3. Неструктурные ранние белки

1.4. Репликация аденовирусов.

1.5. Классификация АВ

1.6. Клиникоэпидемиологическая характеристика и патогенез АВинфекции.

1.7. Современные методы диагностики аденовирусной инфекции.

1.7.1. Выделение вируса в культуре клеток.

1.7.2. Иммунофлуоресцентный метод.
1.7.3. Иммуноферментный анализ ИФА
1.7.4. Моноклональные антитела
1.7.5. Иммунохроматографический анализ
1.7.6. Полимеразная цепная реакция ПЦР
1.8. Противоаденовирусные препараты
1.8.1. Основные направления получения противоаденовирусных препаратов.
1.8.2. Эффективность и недостатки препаратов, используемых для лечения и профилактики аденовирусных инфекций
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Клеточные культуры.
2.1.2. Вирусы.
2.1.3. Моноклональные антитела
2.2. Методы
2.2.1. Вирусологические методы
2.2.2. Методы гибридомной технологии
2.2.3. Электронномикроскопический анализ.
2.2.4. Взятие и подготовка клинических образцов.
2.2.5. Биохимические методы.
2.2.6. Иммунохимические методы
2.2.7. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2.8.Статистическая обработка
ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АДЕНОВИРУСУ
3.1. Оценка специфической активности гипериммунных аденовирусных сывороток кролика в непрямом методе флуоресцирующих антител
3.2. Первичное тестирование получешплх МКА.
3.2.1. Изучение специфической активности в ИФА
3.2.2. Изучение специфической активности МКА с помощью НМФА
3.3. Определение эпитопной направленности МКА
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФИТЦКОНЬЮГАТОВ ПОЛИ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
4.1. Получение и изучение активности ФИТЦконыогатов ПКА.
4.2. Лабораторная апробация МКА6 при дифференциальной диагностике аденовирусной инфекции непрямым иммупофяуорссцентным методом
4.3. Получение и изучение активности ФИТЦконыогатов МКА6.
4.4. Клиниколабораторная апробация ФИТЦконыогатов МКА6 при дифференциальной диагностике аденовирусной инфекции прямым
иммунофлуоресцентиым методом.
ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУ НОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТСИСТЕМ Ы ДЯ ИНДИКАЦИИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ.
5.1. Изучение специфической активности МКА6 и 7Р
5.2. Получение и изучение специфической активности пероксидазных коныогатов МКА6 и МКА 7Б1
5.3. Конструирование иммуноферментных тсстсистсм, предназначенных для детекции аденовирусных антигенов в клеточных культурах и клинических
материалах.
ГЛАВА 6. ДИЗАЙН И КЛИНИКОЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ИММУ НОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТСИСТЕМЫ АДЕНОВИР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АДЕНОВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ В КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ
6.1. Клиниколабораторная апробация ИФТС АДЕНОВИР
6.1.1. Возможности выявление аденовирусного антигена в носоглоточных смывах при использовании ИФТС АДЕНОВИР.
6.1.2. Изучение возможности индикации аденовирусных антигенов в копрофильгратах
6.2. Дизайн ИФТС АДЕНОВИР
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Использование ФИТЦконьюгатов моноклональных антител позволяет выявлять аденовирусы, принадлежащие к различным группам В, С, Е семейства аденовирусов и облегчает интерпретацию результатов за счет большей яркости специфической флуоресценции. Разработанная иммуноферментная тестсистема Аденовир характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью и может быть рекомендована для диагностики аденовирусной инфекции, как при респираторных, так и при кишечных формах заболевания. Методы исследования. Использованы различные методы работы с клеточными культурами, вирусологические, серологические, биохимические, молекулярнобиологические и электронномикроскопические методы исследования, методы гибридомной технологии, очистки и концентрирования вирусных белков, очистки моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии, а также статистические приемы обработки и анализа полученных результатов. В работе использовали пакет прикладных программ ii5,0 для непараметрических выборок. Для расчета показателей диагностической эффективности препарата рассчитывали суммарный показатель совпадения результатов с референтной системой и средний квадрат сопряженности i . Оценка диагностических свойств новых тестсистем для определения аденовирусной инфекции проведена на материалах от 4 больных ОРВИ. Методами сравнения служили иммунофлуоресцентный анализ детекции аденовирусных антигенов в эпителиальных клетках носоглоточного эпителия, иммуноферментный анализ для выявления аденовирусных антител класса I ИФТСI, выделение аденовирусов в культуре клеток, а также выявление ДНК аденовирусов при помощи полимеразной цепной реакции. Внедрение результатов в практику. Разработана научнотехнологическая документация НТД на препарат Иммуноглобулин диагностический флуоресцирующий антигексоновый аденовирусный ИДФАГ. Регламент производства и технические условия на препарат ИДФАГ согласованы с ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, Инструкция по применению 1 от г. Главным государственным санитарным врачом РФ. Препарат ИДФАГ зарегистрирован на территории России Регистрационное удостоверение ФСР 0, внедрен в производство на базе ООО Предприятие по производству диагностических препаратов и используется в различных организациях практического здравоохранения ФГУЗ ЦГЭ, глазные клиники, инфекционные стационары, включая сеть базовых лабораторий по мониторингу за гриппом и ОРВИ в составе Референсцентра при НИИ гриппа СЗО РАМН. Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования, профессиональной переподготовки и сертификационном курсе по специальности Вирусология на базе ПДО СПб ГОУВ Государственной Медицинской академии им. И.И. Мечникова совместно с НИИ гриппа СЗО РАМН. Апробации работы. Материалы исследования были доложены на Международной научнопрактической конференции Молекулярная диагностика инфекционных болезней Республика Беларусь, Минск, , на заседании СанктПетербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов Россия, СанктПетербург, и на XXXI Итоговой научнопрактической конференции Актуальные вопросы инфекционных заболеваний у детей Россия, СанктПетербург, , а также представлены на международной конференции i I VI Канада, Торонто, . Публикации. По материалам исследований опубликовано работ, изних 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК и Методические рекомендации Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом. Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 0 печатных листах, иллюстрирована таблицами и рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы Материалы и методы, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 3 источников, из них отечественных и иностранных авторов, 5 приложений. Личный вклад автора. ИДФАГ, широко внедренного в практику здравоохранения. При участии автора получены и полностью им охарактеризованы моноклональные антитела к гексонному антигену аденовируса. Лично автором изгтовлены экспериментальные серии ФИТЦконыогатов моноклональных антител и изучена их специфическая активность в лабораторных и клинических условиях.