Влияние полиовирусной инфекции на нуклеоцитоплазматический транспорт

• Автор: Лидский, Петр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. НуклеоцитоплазматическиИ транспорт

2. . 1. Строение и свойства ядерпой поры

2. 1. 2. Транспорт макромолекул через ядсриыс поры

2. 1. 3. Регуляция нуклеоцитотазматичсского транспорта отдельных белков.

2. 1. 4. Регуляция систем нуклеоципитлазматического транспорта

2. I. 5. Модификации белков комтскса ядерной поры.

2. 1. б. Нарушения нуксоцитотазматичсского транспорта при апоптозе.

2.2. Общие СВЕДЕНИЯ О ПОЛИОВИРУСЕ.

2.3. Взаимодействие полиовируса и клетки

2. 3. 1. Угнетение клеточной транскрипции.
2. 3. 2. Угнетение кэпзависниой трансляции.
2. 3. 3. Модификация мембран и мембранного транспорта.
2. 3. 4. Перестройка цитоскелета
2. 3. 5. Гибель зараженной клетки.
2. 3. 6. Воздействие на иуклсощипотазматичсский транспорт.
3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
4.1. Методы клонирования ДНК
4. 1. I. Получение ксток компетентной культуры штамма . i ТОР.
4. 1. 2. Трансформация клеток компетентной культуры тазмидпой ДНК.
4. 1. 3. Выделение тазмидпой ДНК
4. I. 4. Рестрикция.
4. I. 5. Обработка щелочной фосфатазой
4. 1. 6. Обработка ДНК фрагментом Кленова.
4. 1. 7. Электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля.
4. I. 8. Лигирование
4. 1. 9. Полимеразная цепная реакция
4. 1. . Ссквсиирование тазмидпой ДНК
4.2. Плазмиды.
4. 2. 1. Исходные тазмиды.
4. 2. 2. Получение тазмид.
4.3. Методы работы с эукариотическими клетками
4. 3. I. Культуры клеток
4. 3. 2. Заражение кзеток вирусом.
4. 3. 3. Трансфекция ксток тазмидпой ДНК.
4. 3. 4. Метод ретровирусной трансдукции и получение моноклонов.
4. 3. 5. Получение лизатов эукариотических клеток.
4. 3. 6. Получение псрмсабтизованшАХ клеток.
4. 3. 7. Выделение ядер.
4.4. Ингибиторы.
4.5. Микроскопия
4. 5. 1. Пммунофлуоресцснция
4. 5. 2. Флуоресцентная микроскопия.
4. 5. 3. Электронная микроскопия
5. РЕЗУЛЬТАТЫ.
5.1. Исследование проницаемости ядерной оболочки в клетке, зараженной полиовирусом
5. I. I. Выход ТтегИНИ из ядра в цитоплазму зараженной клетки
5. 1.2. Создание культуры клеток, экспрессирующих ЗхЕСГРП1.
5. 1. 3. Выход ядерного белка из препаратов ядер зараженных клеток
5. I. 4. Вход ципютазматичсских белков в ядро зараженной клетки.
5.2. Исследование ядерных пор в зараженной полиовирусом клетке
5.3. Исследование механизма повышения проницаемости ядерной оболочки полиовирусом
5. 3. I. Повышение проницаемости ядерной оболочки в отсутствие каспаз 3 и 9.
5. 3. 2. Повреждение ядерной оболочки здоровых клеток, вызванное лизатом из
зараженных клеток.
5. 3. 3. Подавление ингибиторами 2Арго способности полиовируса вызывать выход
белков из ядра
5. 3. 4. Нарушение ядерного транспорта, вызванные экспрессией полиовирусного белка
6. ОБСУЖДЕНИЕ
6.1. Нарушение барьерной функции ядерной оболочки при полиовирусной инфекции
6.2. Разрушение ядерных пор в зараженной полиовирусом клетке
6. 3. 2АГКО ПОЛИОВИРУСА ВЫЗЫВАЕТ НАРУШЕНИЯ ЯДЕР1ЮЙ ОБОЛОЧКИ.
6.4. Взаимодействие вирусов и систем нуклеоцитоплазматического транспорта
6.5. Биологическое значение нарушений нуклеоцитоплазматического транспорта при полиовирусной инфекции
7. ВЫВОДЫ.
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСА бычий сывороточный альбумин
БОЕ бляшкообразующая единица
ВЭМК вирус энцафаломиокардита
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
ДМСО диметилсульфоксид
ДСН додецилсульфат натрия
НБС нормальная бычья сыворотка
НТО нет ранслируемая область
ПАДГ полиакриламидный гель
ФМСФ фенилметасульфонил фторид
ЭДТА этилендиаминтстрауксусная кислота
ЭПА этиленгликольбис2аминоэтиловый эфир , ,тетрауксусная кислота ЭР эндоплазматичсский ретикулум
iii, дитиотриит
i, зеленый флуоресцентный белок 1 константа ингибирования
I i i i, сайт внутренней посадки рибосомы
МРСМК xiIIIvIi ,
метоксисукцинилЬаланилЬаланилЕпролилЬвалин хлорметилкетон
x i, сигнал ядерного экспорта
ii i, сигнал ядерной локализации
x, комплекс ядерной поры
i, домен ядерного транспорта
i, фосфатный буфер
I 1,4iiii i, 1,4 пиперазиндиэтансульфоновая кислота V ii vi , обезьяний вирус
x ii i, ТАТАбокс связывающий белок тозиллинхлорметилкетон
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Воздействие на иуклсощипотазматичсский транспорт. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. I. Получение ксток компетентной культуры штамма . ТОР. Трансформация клеток компетентной культуры тазмидпой ДНК. I. 4. Рестрикция. I. 5. Обработка ДНК фрагментом Кленова. Электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля. I. 8. Плазмиды. Исходные тазмиды. Получение тазмид. Заражение кзеток вирусом. Трансфекция ксток тазмидпой ДНК. Метод ретровирусной трансдукции и получение моноклонов. Получение лизатов эукариотических клеток. Получение псрмсабтизованшАХ клеток. Выделение ядер. Ингибиторы. Флуоресцентная микроскопия. РЕЗУЛЬТАТЫ. I. I. Создание культуры клеток, экспрессирующих ЗхЕСГРП1. I. 4. Вход ципютазматичсских белков в ядро зараженной клетки. I. Повышение проницаемости ядерной оболочки в отсутствие каспаз 3 и 9. АГКО ПОЛИОВИРУСА ВЫЗЫВАЕТ НАРУШЕНИЯ ЯДЕР1ЮЙ ОБОЛОЧКИ. ВЫВОДЫ. Актуальность проблемы. Пикорнавирусы и, в маетности, вирус полиомиелита полиовирус являются возбудителями важных заболеваний человека и животных. Этим во многом объясняется пристальный интерес, который уделяют исследователи этой группе вирусов. В течение последнего десятилетия достигнуты значительные успехи в понимании молекулярнобиологических основ репродукции пикорнавнрусов и вызываемых ими изменений физиологических процессов в зараженной клетке. Вместе с тем, до полного понимания всей картины взаимодействия этих вирусов с клеткой еще далеко. Несколько лет назад в нашей лаборатории был обнаружен еще один интересный аспект воздействия нолиовируса на клетку нарушение нуклеоцитоплазматнческого транспорта. Макромолекулярный состав ядра эукариотической клетки существенно отличается от белкового состава ее цитоплазмы. Эта асимметрия достигается благодаря барьерной функции ядерной оболочки, и за счет действия специальных механизмов транспорта белков, РНК и рнбонуклеопротеидов. Многие вирусы эукариот, часть репликативного цикла которых протекает в ядре, используют эти транспортные механизмы для того, чтобы попасть в ядро или выйти из ядра I . Некоторые из них модифицируют системы нуклеоцитоплазматнческого транспорта в соответствии с собственными интересами i, . Аспекты взаимодействия размножающихся в цитоплазме вирусов к которым относится и полиовирус с транспортными системами клетки пока остаются менее изученными, хотя также представляют значительный интерес. Пели и задачи исследования. В предыдущих исследованиях было показано, что при заражении клеток полиовнрусом происходит нарушение нуклеоцитоплазматнческого транспорта белков ядериые белки оказываются в цитоплазме v . Настоящая работа посвящена исследованию данного эффекта. Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы с помощью флуоресцентных зондов было показано, что ядерная оболочка в инфицированной клетке теряет свою барьерную функцию и становится проницаемой для белков большой молекулярной массы. С подавляющей вероятностью этот эффект связан с деградацией ядерных пор, которая была продемонстрирована с помощью электронной микроскопии. Метод ингибиторного анализа показал, что продукт вируса, ответственный за нарушение ядерного транспорта это протеаза 2Лр,. Индивидуальная экспрессия этого белка в клетках приводила к нарушениям ядерного транспорта, сходным с происходящими при заражении. Углубленное исследование этого явления представляет значительный интерес, поскольку нс только разъясняет проблему взаимодействия цитоплазматического вируса с ядром клетки, по и расширяет наши знания о системах нуклеоцитоплазматического транспорта, их устройстве, регуляции, роли в организации внутриядерного пространства. Апробация работы. По материалам диссертации были опубликованы две статьи. Результаты настоящей работы были доложены на XII и XIII международных конференциях Молекулярная биология никорнавирусов в г. КейпКод, США и в г. Люнтерсне, Голландия соответственно, па международных семинарах по программе ШТАБ в г. Москве, и в г. Финляндии, на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им М. Г. Чумакова.