Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации

• Автор: Шульпин, Михаил Иванович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Историческая справка о вирусной диарее КРС

2.2. Классификация вируса вирусной диареи КРС

2.3. Эпизоотологические и клинические характеристики заболевания

2.4. Морфологические и физикохимические свойства вириона

2.5. Геном вируса вирусной диареи КРС

2.6. Протеины вируса вирусной диареи КРС.

2.7. Репликация вируса вирусной диареи КРС.

2.8.1. Проникновение вируса в клетку.

2.8.2. Трансляция генома вируса вирусной диареи КРС
2.8.3. Процессинг полипротеина.
2.8.4. Репликация генома вируса вирусной диареи КРС
2.8.5. Сборка вирионов и отпочковывание их от клетки.
2.9. Цитопатогенные штаммы вируса вирусной диареи КРС
2 Диагностика вирусной диареи КРС
2 Заключение по обзору литературы
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы.
3.1. Материалы.
3.1.1. Вирус вирусной диареи КРС
3.1.2. Реактивы и ферменты
3.1.3. Растворы и буферные смеси
3.1.4. Оборудование.
3.2. Методы
3.2.1. Расчет праймеров для ПЦР.
3.2.2. Выделение РНК
3.2.3. Обратная транскрипция ПЦР
3.2.4. Очистка продуктов ПЦР
3.2.5. Реакция секвенирования.
3.2.6. Анализ первичной и вторичной структур нуклеиновых кислот
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Стратегия разработки метода выявления генома вируса вирусной диареи КРС.
4.2. Анализ профиля вариабельности 5нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС
4.3. Подбор праймеров для амплификации фрагмента 5нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС
4.4. Оптимизация метода выявления генома вируса вирусной диареи КРС в вируссодержащем материале
4.5. Выявление генома вируса вирусной диареи КРС в патологическом материале
4.6. Выявление контаминации вирусом вирусной диареи КРС клеточных культур
4.7. Оптимизация условий секвенирования фрагмента 5нетранслируемой области генома вируса вирусной диареи КРС
4.8. Генотипирование и анализ нуклеотидных последовательностей выявленных изолятов вируса вирусной диареи КРС.
4.9. Анализ предполагаемой вторичной структуры фрагмента 5нетранслируемой области генома выявленных изолятов вируса вирусной диареи КРС
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Разработан метод выявления вируса ВД КРС, который позволяет с помощью ПЦР обнаруживать геном вируса в различных вируссодержащих образцах, а также проводить генотипирование и штаммовую дифференциацию на основе определения и сравнительного анализа первичной структуры фрагмента 5нетранслируемой области генома вируса ВД КРС. Метод прошел комиссионное испытание, одобрен ученым советом, утвержден директором ВНИИЗЖ и в настоящее время применяется в диагностических исследованиях. С помощью разработанного метода проведен анализ фрагмента 5нетранслируемой области генома изолятов вируса ВД КРС, выявленных в различных образцах патологического материала от животных на территории Российской Федерации в г. Созданная база данных нуклеотидных последовательностей позволяет проводить штаммовую дифференциацию вируса ВД КРС вновь выявленных полевых изолятов. Публикация научных работ. Апробация работы. Результаты диссертации доложены и опубликованы в материалах научнопрактической конференции Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и других этиологий и меры борьбы с ними, Иркутск г. Международной научнопрактической конференции Актуальные проблемы болезней молодняка, Воронеж г. Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота, Владимир г. IV Всероссийской . Генодиагностика инфекционных заболеваний, Москва г. Международной научной конференции молодых ученых Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных, Владимир г. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 2 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения. Список литературы включает 3 источников. Работа иллюстрирована рисунками и 8 таблицами. Российской Федерации. База данных нуклеотидных последовательностей 5нетранслируемой области генома полевых изолятов вируса ВД КРС, выявленных в гг. ВД КРС. Исследования по диссертационной работе выполнены в г. ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных. Автор приносит свою благодарность кандидату биологических наук Аяноту Павлу Константиновичу, научному руководителю доктору ветеринарных наук, профессору Мищенко Владимиру Александровичу за повседневную помощь и консультации при проведении исследований и их оформлении, а также сотрудникам лаборатории Молекулярной диагностики болезней КРС за помощь при выполнении диссертации и отдельных этапов работы. В году было описано высококонтагиозное заболевание крупного рогатого скота с вирусной этиологией, характеризующееся диарейной и респираторной клиникой и низкой смертностью, получившее название вирусная диарея. Впоследствии этиологический агент данного заболевания был назван вирусом вирусной диареи КРС. В году было описано острое течение болезни КРС с низкой контагиозностью и высокой смертностью, характерным проявлением которой было изъязвление слизистой оболочки желудочнокишечного тракта. Исследователям не удалось воспроизвести заболевание экспериментально, его расценили как новое и назвали болезнь слизистых. Лишь спустя много лет была установлена единая этиология этих заболеваний. В г. ВД КРС с вирусом классической чумы свиней ВКЧС, этиологическим агентом заболевания, известного с х годов XIX века, способного вызывать опустошительные эпизоотии во всем мире, а позднее и с вирусом пограничной болезни овец ВПБО 4. В году, . .i предложил объединить эти 3 вируса в группу пестивирусы. Вследствие наличия в структуре вириона липидной оболочки пестивирусы были отнесены к семейству vii. Однако пестивирусы не репродуцируются в организме членистоногих, что является характерной чертой тогавирусов 4, 7. Впоследствии, благодаря работам . и . по изучению нуклеотидной последовательности РНК пестивирусов, их выделили из семейства vii , 0. По современной классификации вирус ВД КРС и родственные пестивирусы овец и свиней относят к семейству vivii, куда также относятся вирус желтой лихорадки и вирус гепатита С ВГС ,.