Биологические свойства природных изолятов вируса болезни Марека, циркулирующих на территории Российской Федерации

• Автор: Джулардов, Геннадий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Историческая справка

1.2. Эпизоотическая ситуация по болезни Марека.

1.3. Характеристика вируса болезни Марека

1.4. Классификация и биологические свойства ВБМ

1.5. Классификация вируса болезни Марека серотипа 1 в соответствии с принципами патотипирования.

1.6. Патотипирование методом i .

1.7. Вирусы БМ серотипа 2

1.8. Вирусы БМ серотипа 3

1.9. Эпизоотологические особенности

1 Клинические признаки.
1 Патологоанатомические и гистологические изменения
1 Диагностика
. Иммунодиагностика ВБМ.
1 Иммунитет
1 Контроль и специфическая профилактика
1 Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Вирусы.
2.1.2. Изоляты ВБМ
2.1.3. Культуры клеток
2.1.4. Испытуемые сыворотки для непрямого ИФА.
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Специфические компоненты
2.1.7. Диагностические наборы.
2.2. Оборудование.
2.3. Методы.
2.3.1. Изоляция ВБМ из крови кур
2.3.2. Трипсинизация куриных эмбрионов
2.3.3. Серотипирование изолятов ВБМ.
2.3.4. Выявление Аг ВЛП р в сыворотке крови кур иммуноферментным анализом.
2.3.5. Выявление вируса ретикулоэндотелиоза ВРЭ в реакции непрямой иммунофлюоресценции РНИФ.
2.3.6. Выявление ВИАЦ методом ГЕЦР в реальном времени
2.3.7. Выращивание и пассирование ВБМ.
2.3.8. Замораживание клеток.
2.3.9. Сбор единичных колоний ВБМ1.
2.3 Титрование вируса болезни Марека
2.3 Выявление Ат к ВБМ в сыворотке крови кур реакцией диффузионной преципитации.
2.3 Получение вирусного Аг для проведения непрямого
2.3 Непрямой вариант ИФА
2.3 Электрофорез в ПААГДСН.
2.3 Иммуноблоттинг
2.3 Л 6. Статистическая обработка результатов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Определение вирулентности полевых изолятов ВБМ1.
3.1.1. Чувствительность СПФцыплят линии Щелково
3.1.2. Выявление контаминации изолятов ВБМ1 чужеродными вирусами
3.1.3. Определение вирулентности изолятов вируса БМ первого серотипа
3.1.4. Первичная оценка вирулентности полевых изолятов вируса БМ первого серотипа на СПФцыгшятах линии
Щелково
3.1.5. Определение патотипа полевых изолятов вируса БМ первого серотипа модифицированным методом i
3.1.6. Географическое распределение изолятов вируса БМ первого серотипа.
3.2. Разработка непрямого варианта твердофазного ИФА для определения поствакцинальиых антител в сыворотке крови кур к вирусу БМ первого серотипа.
3.2.1. Получение антигена
3.2.2. Определение концентрации белка в полученном лизате
3.2.3. Определение структурного состава и антигенной активности вирусного препарата
3.2.4. Разработка иммуноферментной тестсистемы для выявления антител к вирусу БМ.
3.2.5. Приготовление высокоположительного и положительного контролей
3.2.6. Определение параметров внутренних контролей качества
3.2.7. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тестсистемы.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аг антиген
Ат антитело
БМ болезнь Марека
ВБМ вирус болезни Марека
ВБМ1 вирус болезни Марека первого серотипа
ВБМ2 вирус болезни Марека второго серотипа
ВИАЦ вирус инфекционной анемии цыплят
ВЛП вирус лейкоза птиц
ВНА вируснейтрализирующие антитела
ВРЭ вирус ретикулоэндотелиоза
ГВИ ВГИ герпесвирус индеек
ГКГ главный комплекс гистосовместимости
Д далътон
ДМСО диметилсульфоксид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН додецилсульфат натрия
ИАЦ инфекционная анемия цыплят
ИББ инфекционная бурсальная болезнь болезнь Гамборо ИБК инфекционный бронхит кур
ИФ иммунофлюоресценция
ИФА иммуноферментный анализ кД килодальтон
КРС крупный рогатый скот
Ксв. коэффициент связывания
КЭ куриный эмбрион
МкА моноклональные антитела
нИФА непрямой вариант иммуноферментного анализа
ОП оптическая плотность
ОРС открытая рамка считывания
ПААГ полиакриламидный гель
ПНП позитивнонегативный порог
ппо повторы пар нуклеотидных оснований
ПЦ почка цыпленка
ШДР полимеразная цепная реакция
РДП реакция диффузионной преципитации
РИФ реакция иммунофлюоресценции реакция нейтрализации
РНК рибонуклеиновая кислота
СПФ свободный от специфических патогенных возбудителей с англ. ii
синдром ранней смертности
ТМБ тетраметилбензидин гидрохлорид
ФБР фосфатнобуферный раствор
ФБРТ фосфатнобуферный раствор с твином
ФИТЦ флюоресцеин изотиоцианат
ФОЕ фокусообразующая единица
ФЭК фибробласты эмбриона курицы
ФЭП фибробласты эмбриона перепела
ФЭУ фибробласты эмбриона утки
ХАО хориоаллантоисная оболочка
ЦПД ЦПЭ цитопатическое действиеэффект
ЭМ электронная микроскопия
ЭПФ эпителий перьевых фолликул
vi i лаборатория онкологических болезней птиц
АТСС i i американская типовая культуральная коллекция умеренновирулентиый с англ. i v вирулентный с англ. vi
высоковирулентный с англ. v vi vv сверхвирулентный с англ. v vi .
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Однако, им трудно руководствоваться в других лабораториях, поскольку авторы, для оценки вирулентности полевых изолятов ВБМ1 в экспериментальных условиях используют чувствительных к ВБМ линию СПФкур x7 аЬ, доступную в основном только в США. Для устранения этого препятствия i предложил провести сравнение патологоанатомических изменений, вызываемых референтными и полевыми штаммами вируса БМ, с использованием других чувствительных к ВБМ СПФлиний кур. Этот метод был апробирован с положительными результатами на двух американских СПФлиниях кур и получил название i 3. Однако сообщений о подтверждении достоверности данного метода в независимых лабораториях не поступало. В нашей стране подобных исследований не производили. Изза экономического кризиса, который длился в. БМ, включая изучение полевых изолятов, также как и усовершенствование мер борьбы с заболеванием практически не проводились. Изза отсутствия диагностических центров, вопрос о циркуляции в птицеводческих хозяйствах штаммов ВБМ1 с различной степенью вирулентности от авирулентных до сверх вирулентных не изучали. Хотя стоит отметить, что в более ранних исследованиях по БМ отечественными авторами было опубликовано несколько сообщений по выделению различных изолятов ВБМ при вспышках болезни в хозяйствах Коровин, , , Лавров, , Мазуренко, , Яковлева, , , однако, отсутствие стандартных методик не позволило в полной мере охарактеризовать вирулентность полученных изолятов. С конца х гг. БМ в инфекционной патологии птиц стала возрастать. В этот период снова начала прослеживаться опасная тенденция по учащению случаев БМ и увеличению неблагополучных районов. Можно сказать, что возникла ситуация, когда БМ наблюдали почти в каждом птицехозяйстве страны. Среднегодовой падеж птицы от БМ мог достигать от всех инфекционных болезней В. И. Смоленский, , неопубликованные данные. В очередной раз одной из основных причин ухудшения эпизоотической ситуации могла явиться циркуляция вновь появившихся в природе высоко и сверхвирулентных форм ВБМ1. Все это обусловило необходимость разработки и использования метода патотипирования ВБМ1, не только для оценки эпизоотической ситуации, но и изучения распространения и эволюционной изменчивости вируса. Используя модификацию метода i, мы пытались выявить новые высокопатогенные штаммы ВБМ1 на территории РФ с целью усовершенствования стратегии вакцинации и применения соответствующих мер контроля. Другой потенциальной причиной вспышек БМ среди вакцинированного поголовья кур кроме циркуляции в хозяйствах высоко и сверхвирулентных форм ВБМ1 может быть не всегда удовлетворительное проведение мероприятий по специфической профилактике против БМ. В связи с этим необходим систематический контроль гуморального ответа птицы на введение вакцинного штамма ВБМ. В настоящее время для серологической диагностики БМ применяют РДП, реже и ИФ. Об использовании ИФА, обладающего гораздо более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с вышеуказанными методами, в литературных данных имеются весьма ограниченные сведения. Это может быть связано с рядом причин, таких как перекрестная реактивность, высокий неспецифический фон реакции , а также неудовлетворительная чувствительность тестсистемы 7. Очевидно, что вышеуказанные проблемы были связаны с источником получения антигена ВБМ, полученного на клетках куриного происхождения ФЭК, ГП 0. Для устранения этого недостатка необходимо было использовать культуру клеток другой природы, чувствительную к ВБМ. Такой культурой оказалась рекомбинантная линия клеток БСЕ, полученная из фибросаркомы перепела 8, 1. Наличие подобной клеточной системы позволяло получить вирусный антиген БМ, пригодный для разработки тестсистемы на основе непрямого варианта ИФА с целью обнаружения антител к ВБМ. Данная тестсистема могла служить ценным инструментом при проведении ретроспективной диагностики и оценки эффективности специфической профилактики против БМ. Целью исследований явилось изучение биологических свойств российских природных изолятов вируса болезни Марека первого серотипа ВБМ1 и разработка иммуноферментной тестсистемы для выявления антител к ВБМ1 для оценки эффективности вакцин.