Идентификация возбудителей блютанга и эпизоотической геморрагической болезни оленей с помощью полимеразной цепной реакции

• Автор: Снетков, Константин Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 124 с. : ил

В настоящее время для лабораторной диагностики блюганга и ЭГБО используются реакция нейтрализации, реакции гемагглютинации, задержки гемагглютинации, диффузионной преципитации, связывания комплемента, метод флюоресцирующих антител и твердофазный иммуноферментный анализ. Каждый из этих методов имеет определенные достоинства и недостатки в плане чувствительности, воспроизводимости и экспрессности 3,4, , ,, ,,, 0, 1, 2, 2, 9, 0, 1. Определенные трудности при идентификации возбудителей представляет существование серотипов вируса блютанга и 9 серотнпов ЭГБО, а также наличие тесного антигенного родства между этими вирусами, которые ограничивают возможности серологических методов при постановке диагноза. Применение существующих тестов лабораторной диагностики, в которых используются поликлональные антитела, не всегда позволяет проводить дифференциацию штаммов вирусов блютанга и ЭГБО. В последние годы для изучения свойств орбивирусов животных Применяются методы с использованием моноклональных антител 0. Во ВНИИВВиМ Стрижаковым, М. ИФА , , , , , . С целью дифференциации вируса ЭГБО Лунициным был разработан Набор препаратов. Анализ данных литературы показывает, что, несмотря на ряд преимуществ традиционных методов диагностики блютанга и ЭГБО, во многих лабораториях за рубежом все шире и шире для диагностики используются методы молекулярной гибридизации и полимеразная цепная реакция. Преимуществами этих методов являются их высокая чувствительность, специфичность, быстрота и безопасность 5, , , , , , , , , , 8, 4. Для сравнительной характеристики геномов вирусов различных серотипов в настоящее время также находит применение рестрикционный анализ ПЦР продуктов 5, , , ,. Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции, дополняя серологические методы, открывает новые возможности при разработке тестсистем для идентификации и дифференциации вирусов блютанга и ЭГБО. Одним из перспективных направлений исследований является использование ГИДР с последующим рестрикционным анализом и секвенированием продукта ГИДР. В связи с вышеизложенным, вопрос о разработке новых высокочувствительных и специфичных методов идентификации патогенных орбнвирусов животных остается актуальным. Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка Наборов препаратов. Провести дифференциацию различных серотипов вируса блютанга на основе праймеров, комплементарных вариабельному участку генома, а также с помощью рестрикционного анализа ЦР продуктов. Научная новизна работы. Подобраны специфические праймеры и отработаны условия постановки ПЦР, позволяющей выявлять РНК вирусов блютанга и ЭГБО в пробах патологического материала и инфицированных клеток. Методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР, комплементарных участку пена Мб, выявлены отличия в последовательностях нуклеотидов вируса блютанга 2, 4, 9, , , и го серотипов. Доказана гомология последовательностей нуклеотидов штамма Тапхар серотила, выделенного на территории Республики Бурятия, с австралийскими штаммами того же серотипа. Показана возможность дифференциации вируса блютанга 9 и го серотипов при помощи ПЦР с праймерами, комплементарными вариабельному участку гена 2. Практическая значимость. Разработанные Набор препаратов для выявления РНК вируса блютанга методом ПЦР и Набор препаратов для выявления РНК вируса ЭГБО методом ПЦР позволяют обнаруживать РНК этих вирусов в культуре инфицированных клеток, пробах головного мозга зараженных мышей и крови овец. Рекомендуемый рестрикционный анализ ПЦР продукта, комплементарного гену Мб позволяет дифференцировать вирусы блютанга 2, 4, 9, , , и го серотипов. Применение методов ПЦР и рестрикционного анализа для дифференциации различных серотипов вируса блютанга. Апробация результатов исследований. Исследования по диссертационной работе выполнены в г. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены па заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ , , гг. Биологоэкологнческие проблемы заразных болезней диких животных, и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей ВНИИВВиМ г. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов ВНИТИБП Щелково, г.