Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств

• Автор: Адиева, Айна Ахмедовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 290 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ЦИТОМЕГАЛОВИРУС ЧЕЛОВЕКА

1.1. Структура и репликация

1.2. Внутриутробная инфекция и перинатальная патология.

1.3. Методы лабораторной диагностики ЦМВИ .

1.4. Поиск и изучение новых противовирусных агентов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе

Пациенты.
Культура клеток
Определение инфекционной активности вируса.
Исследуемый материал
Выявление возбудителей ВУИ в материале аутопсии.
Быстрый культуральный метод БКМ.
олимеразная цепная реакция ПЦР.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени ПЦР i
Полимеразная цепная реакция ПЦР i i
Реакция иммуноперципитации.
Твердофазный иммуноферментный анализ тИФА
Авидность антител
Анализ интерферонового статуса.
Определение цитотоксичности АПФ
Определение антивирусной активности АПФ
Определение продукции ипфекционно активного вируса.
Радиоавтография
Пролиферативная активность клеток ФЛЭЧ в присутствии АПФ
Статистические методы анализа
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 3. ФАКТОРЫ РИСКА ВНУТРИУТРОБНОГО
ИНФИЦИРОВАНИЯ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО
3.1. Ретроспективный анализ историй матерей умерших детей.
3.2.Скрининговое вирусологическое обследование жепщин.
3.3. Выявление патогенов на отпечатках органов умерших и плацент .
Глава 4. РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ДИАГНОСТИКИ ЦМВИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ОСЛОЖНЕННЫМ ТЕЧЕНИЕМ РАННЕГО НЕОНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА
4.1. Часюта обнаружения прямых маркеров ЦМВИ у новорожденных детей количественным вариантом БКМ, ПЦР i и ПЦР
4.2. Частота обнаружения маркеров ЦМВИ у новорожденных детей методами серодиагностики
4.3. Выявление маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни.
Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦМВИ У ПЛОДОВ И ДЕТЕЙ, УМЕРШИХ НА ПЕРВОМ ГОДУ ЖИЗНИ
5.1. Сравнительный анализ выявления ЦМВИ у плодов, умерших новорожденных детей и детей, умерших на первом году жизни
5.2. Сравнительный анализ выявления антигенов ЦМВ в материале аутопсии различными иммунореагентами
5.3. Использование метода ПЦР i i для выявления ДНК ЦМВ и ВПГ на отпечатках органов.
Глава 6. АНАЛИЗ ВКЛЮЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН И НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ
6.1. Влияние преконцепционной подготовки женщин с ОАГА на течение беременности и исходы родов
6.2. Использование Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности до родов
6.3. Анализ включения Виферона в комплексное лечение ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей
Глава 7. ПОИСК НОВЫХ СУБСТАНЦИЙ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ЦМВ ЧЕЛОВЕКА I VI
7.1. Изучение цитотоксичности АПФ.
7.2. Изучение антивирусной активности АПФ.
7.3. Влияние АПФ на синтез вирусных белков в инфицированных клетках.
7.4. Сочетанный эффект АПФ и Виферона.
Глава 8. ВЛИЯНИЕ ЦМВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК И КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ.
8.1. Влияние экспрессии вирусных белков на развитие патологии митоза в инфицированной кульзуре
8.2. Изменение пролиферативной активности клеток культуры, зараженной ЦМВ в , i и периодах клеточного цикла.
8.3. Влияние ЦМВИ на продолжительность клеточного цикла в асинхронно делящейся культуре.
8.4. Развитие ЦПД вируса в клетках, инфицированных в состоянии покоя и в фазе клеточного цикла.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Первой вирусной частицей, образующейся в инфицированных клетках, является Вкапсид, представляющий собой белковый каркас нуклеокапсида 1 1. Основными белками капсида являются минорный капсидный белок шСР, мажорный капсидный белок МСР, минорный капсид связывающий белок тСВР, малый капсидный белок БСР и так называемый белок сборки АР 6 1. В отличие от других капсидных белков АР фосфорилирован и образуется путем протеолитического разрезания предшественника АР, кодируемый геном ЦЬ. АР играет непосредственную роль в процессе сборки вирусных частиц и ассоциирован с белками МСР, шСВР и БСР 1 3 1. Вторым этапом сборки вириона является упаковка вновь синтезированной ДНК ЦМВ в зрелые Вкапсиды. Определено, что в этом процессе участвуют высокомолекулярные белки рас1 и рас2, которые освобождают ДНК из репликативного комплекса, разрезают молекулу
нуклеиновой кислоты на два фрагмента и и способствуют ее проникновению в капсид 6. Следующий этап сборки приобретение нуклеокапсидом тегументного слоя. Капсиды с вирусной ДНК, окруженной тегу ментом, называются Скапсидами. Их выделяют из инфицированных клеток, обработанных детергентом нонидет 1. Скапсид уже не содержит АР 3. Выход Скапсида из клетки последний этап образования вирионов, при котором нуклеокапсид одевается клеточной мембраной, модифицированной гликопротеинами вирусного происхождения. Известно, что большая часть вирусных частиц покидает клетку через эндосомальные структуры 2 3. В процессе репликации ЦМВ помимо трех описанных выше вирусных частиц Вкапсида, Скапсида и вирионов образуются еще два типа вирусных частиц 5. Это неинфекционные оболочечные частицы i. Они имеют такое же строение, как и вирионы, но в отличие от последних не содержат ДНК, а, следовательно, не обладают инфекционностью. Второй тип вирусных частиц вирусные частицы высокой плотности , также не содержат ДНК. Они представляют собой агрегаты белка тегумента рр, окруженного мембраной 2 5 9. В культуре ЦМВинфицированных фибробластов синтезируются в большом количестве до от всех внеклеточных вирусных частиц 8. Электронномикроскопические исследования обнаружили i viv в циркулирующих цитомегалических клетках у пациентов с острой ЦМВинфекцией, что указывает на синтез этих вирусных частиц i viv 7. Развитие вирусной инфекции i viv и связанную с ней патологию невозможно понять без выяснения механизмов взаимодействия вируса и клетки. Накопленные данные позволяют представить события в клетке, индуцируемые IМВ. Каскад изменений клеточного метаболизма инициируется при взаимодействии вируса с мембранассоциированными специфическими рецепторами, которые селективно модифицируют ферменты, связанные с плазмалеммой например фосфолипазы С и А2, протеинкиназа С, аденилатциклаза, повышая их ферментативную активность. Вследствие этого происходит увеличение концентрации вторичных мессенджеров, таких как инозит1,4,5трифосфата, 1,2
диацил глицерина, внутриклеточного свободного Са , арахидоновой кислоты и ее метаболитов, цАМФ, цГТФ 5 2. Некоторые из указанных мессенджеров, такие как диацил глицерин, сохраняются в составе мембраны, в то время как другие, например, Са2, функционируют в цитоплазме, активируя специфические протеинкиназы 9. Повышенный уровень клеточных активаторов приводит к увеличению синтеза ряда макромолекул ДНКполимеразы, ДНКзависимой РНКполимеразы, орнитиндекарбоксилазы, метионинаденозиндекарбоксилазы, экзонуклеазы, топоизомеразы 2, дигидрохолат редуктазы рИРЯ 0 9 6. Активированные протеинкиназы фосфорилируют специфические белки, часть из которых оказывает влияние на внутриядерные регуляторные факторы, приводя к индукции клеточных генов, в том числе связанных с клеточным циклом например, протоонкогены Рэб, ип, туе 0, антионкогены р и ЛЬ, ряд циклинов 7 0 8 6. До недавнего времени предполагали, что ЦМВиндуцированное увеличение уровня вторичных мессенджеров, синтез иили активация большинства макромолекул стимулирует клеточный механизм репликации ДНК иили подавляет функции ферментов, негативно регулирующих клеточную пролиферацию. Это мнение было экспериментально подтверждено в работах х годов.