Выделение и культивирование вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов

• Автор: Гаврилова, Вера Львовна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 168 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведении о репродуктивнореспираторном синдроме свиней

1.1.1. Основные пути распространения, клинические признаки и патологоанатомические изменения при РРСС

1.1.2. Локализация вируса РРСС в организме свиней.

1.2. Иммунобиологическая характеристика вируса РРСС.

1.2.1. Классификация, морфология и химический состав

1.2.2. Генетическая, антигенная вариабельность и родство штаммов вируса РРСС.

1.2.3. Репродукция вируса РРСС i viv и i vi.

1.3. Культуральные свойства вируса РРСС.

1.3.1. Культивирование вируса РРСС в первичных и перевиваемых
культурах клеток
1.3.2. Титрование вируса РРСС с использованием различных культур клеток
1.4. Методы диагностики РРСС
1.4.1. Выделение и идентификация вируса РРСС
1.4.2. Серологические методы диагностики РРСС.
1.5. Иммунитет при РРСС.
1.5.1. Клеточный иммунитет
1.5.2. Гуморальный иммунитет
1.6. Вакцины против РРСС
1.7. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1.1. Вирусы.
2.1.2. Культуры клеток
2.1.3. Подопытные животные
2.1.4. Сыворотки и питательные среды
2.1.5. Оборудование, химреактивы, конъюгаты и растворы
2.1.6. Культивирование вируса РРСС.
2.1.7. Определение инфекционного титра вируса РРСС
2.1.8. Очистка и инактивация вирусного материала
2.1.9. Адъюванты.
2.1 Изготовление вакцины.
2.1 Определение антигенной активности вакцины
2.1 Заражение животных испытуемым вируссодержащим материалом.
2.1 Постановка серологических реакций
2.1 Обработка полученных результатов.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.2.1. Культивирование вируса РРСС в перевиваемой культу ре клеток 5 и альвеолярных макрофагах свиней АМС
2.2.1.1. Культивирование перевиваемой культуры клеток 5.
2.2.1.2. Особенности репродукции вируса РРСС, штамма , в перевиваемой культуре клеток 5.
2.2.1.3. Изучение особенностей репродукции вируса РРСС, штамма V,
в перевиваемой культуре клеток
2.2.1.4. Культивирование вируса РРСС в альвеолярных макрофагах свиней
2.2.1.5. Изучение иммунобиологических свойств вируса РРСС, штамма ,
на подсвинках.
2.2.2. Оптимизация лабораторных методов выделения и обнаружения
вируса РРСС.
2.2.2.1. Оптимизация непрямой реакции иммунофлюоресценции для выявления
антигена вируса РРСС.
2.2. Выделение вируса РРСС от экспериментально зараженных животных.
2.2.3. Выделение и изучение иммунобиологических свойств полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих среди свинопоголовья на территории России
2.2.3.1. Изучение иммунобиологических свойств некоторых изолятов
вируса РРСС на поросятах
2.2.3.2. Выделение вируса РРСС в АМС
2.2.3.3. Выделение вируса РРСС в перевиваемой культуре клеток МАЯС
2.2.3.4. Испытание чувствительности к вирусу РРСС различных первичных, перевиваемых культур клеток и куриных эмбрионов.
2.2.4. Изучение иммунобиологических свойств нзолята
Кемеровский вируса РРСС
2.2.4.1. Культуральные свойства изолята Кемеровский
вируса РРСС.
2.2.4.2. Изучение иммунобиологических свойств изолята Кемеровский
на свиньях
2.2.4.3. Контроль изолята Кемеровский на специфичность и отсутствие контаминации
2.2.4.4. Изучение антигенной активности изолята Кемеровский
2.2.5. Оптимизация и модификация методов оценки антигенной
активности вакцин против РРСС
2.2.5.1. Оптимизация и модификация реакции нейтрализации
для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней и кроликов.
2.2.5.2. Оптимизация и модификация непрямой реакции иммунофлюоресценции НРИФ для выявления антител к вирусу РРСС
в сыворотках крови свиней и кроликов.
2.2.5.3. Оптимизация и модификация реакции непрямой гемагглютинации РИГА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней
и кроликов.
2.2.5.4. Оптимизация и модификация непрямого метода иммуноферментного анализа ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Репродуктивные нарушения на поздних стадиях супоросности характеризуются абортами, рождением мертвых и мумифицированных поросят 4, 5, 1. Во время острых вспышек аборты могут быть у свиноматок в стаде. В естественных условиях поросята могут быть инфицированы вирусом РРСС интраназально, парэнтерально и трансплацентарно, что может привести к персистенции вируса, а в экспериментальных условиях также внутримышечно и подкожно. Вирус РРСС инфицирует сначала АМС. Продолжительная виремия и поражение лимфатических тканей приводит к инфицированию других субпопуляций макрофагов, к персистенции вируса. Лимфатические узлы могут быть увеличены. Может развиться тяжелая пневмония у поросят, осложненная вторичной бактериальной инфекцией, и другие микроскопические поражения тканей, приводящие к миокардитам, васкулитам, энцефалитам, лимфоидной гипертрофии и гиперплазии 1, 9, 8. С. также считали, что при интраназальном заражении поросят вирус первоначально попадал в АМС и миндалины, где репродуцировался, затем в течение 3 дней виремии происходило инфицирование других субпопуляций макрофагов и распространение вируса внутри организма с током крови, в это же время начинала развиваться интерстициальная пневмония . Тяжесть развития интерстициальной пневмонии может варьировать в зависимости от степени вирулентности изолята. Патологические изменения в бронхах, бронхиолах и дыхательных капиллярах проявлялись в виде скопления слизи и отслоившихся клеток эпителия, потери ресничек клетками мерцательного эпителия 1. Помимо данных патологических изменений, может присутствовать отек подкожной, околопочечной и брюшинной клетчатки, брыжеечных лимфоузлов и мышц, разные уродства у мертворожденных и слаборожденных поросят 1. В полевых условиях, кроме того, регистрировали цианоз вульвы, хвоста, брюшных стенок, пятачка, симптомы поражения ЦНС в виде паралича, нарушении координации движения, чрезмерной возбудимости 1. В зависимости от вирулентности изолята и срока суиоросности, на котором свиноматки подверглись инфицированию, степень инфицирования приплода может составлять от 4 до , а мертворождаемость от 0 до 0 5, 3. При повторных опоросах свинохматки могут приносить нормальный приплод 4. У поросят, инфицированных вирусом РРСС до рождения, отмечали наличие микроскопических поражений, характерных для тяжелого менингоэнцефалита, некротическую интерстициальную пневмонию и воспаление кишечной мускулатуры. Наличие вируса РРСС в макрофагах и клетках микроглии мозга поросят подтвердили при помощи вирусовыделения, метода сьютигибрилизации, ИПМА, иммунофлюоресцентной микроскопии замороженных срезов легких и мозга, а также и серологически 1. В лабораторных условиях при инфицировании животных интраназально, интратрахеально, внутримышечно или в результате содержания здоровых свиней с больными могут наблюдать отсутствие аппетита, повышение температуры тела до ,6С, кашель, длительную диарею в течение 7Ю недель, посинение ушей и даже гибель отдельных животных , 4. РРСС не оказывали влияния на развитие клинических признаков и тяжесть заболевания, а только на длительность инкубационного периода заболевания. Однако оказалось, что способ заражения влиял на интенсивность иммунного ответа на вирус РРСС внутримышечное заражение стимулировало в большей степени выработку антител, чем интраназальное 8. Они считали, что существует прямо пропорциональная зависимость между возрастом поросят, дозой заражения, патогенностью изолята вируса РРСС и тяжсстыо проявления заболевания 6. РРСС у поросят, а также на длительность виремии. Поросят заражали орально, интраназально и внутримышечно изолятом V вируса РРСС в различных дозах. Экспериментальные поросята в данном опыте были более чувствительны к заражению вирусом РРСС парэнтералыю 1. Чаще всего, виремию регистрировали через дня после заражения в течение дней, но, иногда, и значительно дольше до дней. Геном вируса РРСС выявляли в ПЦР в пробе сыворотки крови, полученной от поросенка, родившегося от инфицированной вирусом РРСС свиноматки, через 0 дней после рождения 1.