Разработка тест-системы для выявления вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

• Автор: Найденова, Екатерина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

1.2. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Вирусные штаммы, используемые в работе

2.2. Сбор, учет, хранение и доставка полевого материча

2.2.1. Сбор доставка и хранение проб клещей

2.3. Сбор, обработка и хранение сывороток крови людей

2.4. Исследование материала методом ИФА

2.4.1. Подготовка проб для исследований

2.4.2. ИФА на выявление вирусных антигенов
2.5. Исследование материала с помощью полимеразной цепной реакции
2.5.1. Подготовка проб для исследований
2.5.2. Проведение ПЦР
2.5.3. Получение рекомбинантного положительного контрольного образца
2.6. Методы статистической обработки результатов
Глава 3.
Глава 4.
Глава 5.
СОЗДАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙКОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ОТПЦР
3.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров па основе анализа генома вируса КрымскойКонго геморрагической лихорадки
3.2. Разработка оптимальных условий ПЦР
3.3. Разработка схемы подготовки проб для ОТПЦР
3.4. Создание положительного контрольного образца
3.5. Характеристика тестсистемы для выявления РНК вируса КрымскойКонго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ККГЛ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
4.1. Программа комиссионных испытаний
4.2. Лабораторных контроль серий препарата и исследование вирусных штаммов и материала, искусственно инфицированного вирусом ККГЛ
4.3. Обследование полевого материала
4.4. Исследование сывороток крови больных КГЛ
4.5. Оценка тсстсистемы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТПЦР
ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ККГЛ МЕТОДОМ ОТПЦР ПРИ
МОНИТОРИНГЕ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ кгл
5.1. Апробация тестсистемы в ходе мониторинга природных очагов КГЛ
5.2. Использование тестсистемы для изучения циркуляции вируса ККГЛ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,
СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ ГЭ геномэквивалент
БСА бычий сывороточный альбумин
Вирус ККГЛ вирус КрымскойКонго геморрагической лихорадки ПИСК ГоударС вснньй инс и у самдар изации и контроля
медицинских биологических препаратов ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ дезоксинуклеотидфосфат
ИФА иммуноферментный анализ
КГЛ Крымская геморрагическая лихорадка
КРС крупный рогатый скот
МИБП медицинские иммунобиологические препараты
ПЦР полимеразная цепная реакция
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
РА реакция агглютинации
РСК реакция связывания комплемента
РНГА реакция непрямой пассивной гемагглютинации
РНК рибонуклеиновая кислота
нбм новорожденные белые мыши
н.о. нуклеотидные основания
ТАЕ трисацетатЭДТА буфер
Трис гидроксиметил аминометан
ЭДТА этилендиаминтетроуксусной кислоты натриевая соль
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Это послужило предпосылкой для расширения ареала возбудителей ряда арбовирусных инфекций и формирования новых природных очагов. При этом произошло особенно резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по Крымской геморрагической лихорадке КГЛ. Возникновение вспышек этого заболевания в гг. КрымскойКонго геморрагической лихорадки ККГЛ ранее не наблюдалась Волгоградская область, Республики Калмыкия, Ингушетия, Дагестан Бутенко А. М., Ларичев В. Ф., , Онищенко Г. Г. и др. За эти годы на юге европейской части России в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Ставропольском крае и других регионах было зарегистрировано 9 случаев заболеваний людей КГЛ. КГЛ. В настоящее время для лабораторной диагностики КГЛ используются методы, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и позволяющие проводить анализ большого количества образцов за непродолжительное время Карань Л. С. и др. Смирнова С. Е., . В первую очередь эго различные модификации ИФА. Существенным недостатком ИФА является необходимость исследования парных сывороток крови взятых у больного в динамике заболевания, что значительно снижает диагностическую ценность метода. Кроме этого, чувствительность и специфичность ИФА ниже, чем методов генодиагностики, и, в частности, ПЦР. Создание и практическое внедрение ГЩРтестсистемы, предназначенной для выявления РНК вируса ККГЛ, будет способствовать решению многих актуальных задач быстрой постановке предварительного диагноза, эффективной детекции возбудителей в биологическом материале и объектах внешней среды, что позволит адекватно оценить сложившуюся эпидемиологическую ситуацию и своевременно проводить противоэпидемические мероприятия. Цель работы разработка и внедрение в практику эпидемиологического обследования тестсистемы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТПЦР. Разработать тестсистему дзя выявления РЖ вируса ККГЛ методом ОТПЦР. Разработать нормативную документацию к тестсистеме фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка. Провести Государственные испытания тестсистемы для выявления РНК вируса ККГЛ. Сконструировать рекомбинантный положительный контрольный образец к созданной тестсистеме. Изучить возможность использования ПЦРанализа при обследовании территорий с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ. Впервые разработана тестсистема для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТПЦР ГенКонго. Проведена ее апробация на полевом и клиническом материалах, определена диагностическая ценность в сравнении с ИФЛ и вирусологическими методами. ОТПЦР. Результаты Государственных испытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. Тарасевича протокол от . Получены рекомендации комитета МИБП о регистрации препарата Тестсистема для выявления РНК вируса Крымской Конго геморрагической лихорадки методом ОТПЦР в Российской Федерации и внедрении его в практику здравоохранения протокол т 5 от . На тестсистему для выявления РНК вируса КрымскойКонго геморрагической лихорадки методом ОТПЦР разработана нормативнотехническая документация фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка. В Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб г. Саратов депонирован генетически модифицированный штамм . I , на основе которого был сконструирован положительный контрольный образец к разработанной ПЦРтестсистеме и стандартный образец предприятия СОПк, используемый при контроле чувствительности и специфичности диагностического препарата в условиях производства. ПЦРтесгсистема апробирована мри обследовании территории Саратовской области с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ, а также при мониторинге природных очагов КГЛ в Волгоградской и Астраханской областях. Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ Микроб и на курсах повышения квалификации ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов.