Изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков вируса Западного Нила

• Автор: Богачек, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 162 с. : ил.

Введение
Глава 1. Обзор литературных данных. Морфологическая, эпидемиологическая и клиническая характеристика ВЗН.

1.1. Общая характеристика ВЗН.

Классификация флавивирусов.

1.2. Эпидемиология ВЗН.

1.3. Клиническая картина ЛЗН.

1.4. Циркуляция ВЗН в природных очагах.

1.5. Структура вириона ВЗ и родственных

флавивирусов.

1.6. Цикл репродукции флавивирусов в клетке хозяина.

1.7. Моноклональные антитела против структурных белков ВЗН и их использование для изучения антигенной структуры.
1.8. Рекомбинантные белки, моделирующие структурные белки Е и М флавивирусов.
1.9. Заключение. Глава 2. Исходные материалы и основные методы.
2.1. Исходные материалы.
2.2. Основные методы.
2.2.1. Животные.
2.2.2. Вирус, клеточные культуры.
2.2.3. Получение поликлональных и моноклональных антител.
2.2.4. Криоконсервация гибридных клеточных линий.
2.2.5. Наработка препаративных количеств МКА i viv.
2.2.6. Очистка препаратов МКА.
2.2.7. Биотинилирование белков.
2.2.8. Иммуноферментный анализ.
2.2.9. Электрофорез.
2.2 Иммуноблотинг.
2.2 Конкурентный иммуноферментный анализ.
2.2 Реакция нейтрализации.
2.2 Реакция торможения гемагглютинации.
2.2 Моделирование трехмерной структуры белков Е и М флави вирусов.
2.2Измерение константы аффинности.
2.2 Определение класса и подкласса иммуноглобулинов
2.2 Получение рекомбинантных полипептидов Глава 3. Результаты и обсуждение исследований.
3.1. Исследование схожести пространственной структуры белка Е флавивирусов. Выбор участков белка Е и белка ВЗН для имитирования антигенной структуры.
3.2. Изучение способности полипептидов .i, Е,
имитировать антигенную структуру белков Е и РгМ ВЗН.
3.3. Получение моноклональных антител к рекомбинантному полипептиду Е
3.4. Картирование эпитопов 1го и Нго доменов белка Е ВЗН. Заключение по исследованию концевого фрагмента а.о. белка Е ВЗН.
3.5. Исследование иммунохимических свойств МКА против рекомбинантного фрагмента Е2о4бб ВЗН.
3.6. Картирование эпитопов, узнаваемых МКА. Перекрестная реактивность МКА.
Заключение по исследованию С концевого фрагмента белка Е ВЗН.
3.7. Получение коллекции МКА против белка РгМ ВЗН. Свойства моноклональных антител против белка РгМ ВЗН.
3.8. Изучение взаимодействия МКА против белка ргМ с рекомбинантными фрагментами МзЕ.з0и Е2бо4бб
3.9. Изучение взаимодействия МКА против белка ргМ ВЗРТ с реКОМбииаНТНЫМ ПОЛИПепТИДОМ Е2б
3 Изучение биологической активности МКА методами и РТГА. Эпитопы, распознаваемые созданными МКА.
3 Моделирование пространственной структуры схожих участков белков Е и М вируса Денге и ВЗН.
Заключение по исследованию белков М и РгМ ВЗН.
Заключение.
Выводы.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Благодарности.
Список используемой литературы


В настоящее время ареал ВЗН охватывает полностью территорию США, южных провинций Канады, север Мексики и страны Карибского Бассейна i . Ежегодно регистрируется высокая заболеваемость ЛЗН, в году выявлено случаев ЛЗН со 5 летальными исходами vivii. Повышению заболеваемости способствует наличие множества путей передачи ВЗН наряду с заражением ВЗН посредством укуса комаров, описано инфицирование человека при переливании крови, кормлении грудью, трансплантации органов, пересадки стволовых клеток. Отсутствие диагностических систем для проверки донорской крови и органов на наличие ВЗН может привести к увеличению числа иатрогенных случаев заражения людей. Таким образом, всемирное распространение ВЗН и рост заболеваемости ЛЗН повышает актуальность задач по созданию специфических средств профилактики, диагностики и лечения данного заболевания. На современном этапе решение проблемы связано с исследованием антигенной структуры флавивирусов и выявлением наиболее иммунологически значимых участков структурных белков для последующего применения знаний в области создания полиэпитопных вакцин и систем диагностики. Ранее картирование антигенных детерминант вирусов Марбург и Эбола было успешно проведено с использованием технологии создания рекомбинантных полипептидов i . V. , Рудзевич Т. Н. и др, . В данной работе использовался этот же подход для картирования антигенных детерминант структурных белков ВЗН, формирующихся из различных фрагментов полипептидной цепи. Принципиальным отличием использованного подхода было наличие данных рентгеноструктурного анализа белка Е ВКЭ, что позволило, используя структурную схожесть белка Е флавивирусов, сконструировать короткие рекомбинантные полипептиды с минимальными нарушениями структуры доменов. Цели и задачи исследования. Основной целью нашей работы являлось изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков Е и М ВЗН. М, М и белка Е
Научная новизна и практическая ценность. ЬЕ1УУ9Иитап У 9 ВЗН. МКА участок а. Е ВЗН. Впервые получены МКА, распознающие район 6 а. Ранее Протопоповой Е. Протопопова Е. В. с соавт. МКА ЮН между и а. Е, взаимодействующего с ламинисвязывающим белком ЛСБ на поверхности клеток. Мозаичность взаимодействия МКА с короткими рекомбинантными полипептидами и белком Е вируса клещевого энцефалита позволила выявить не менее шести различных антигенных детерминант в составе доменов I и II гликопротеина Е ВЗН. Результаты конкурентного ИФА позволили идентифицировать не менее 7 различных эпитопов в составе участка 0 6 а. Е ВЗН. Полученные данные показали, что полипептид Егбо6 содержит эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител и антител с антигемагглютинирующей активностью. Впервые созданы рекомбинантные полипептиды с аминокислотной последовательностью, соответствующей белкам М и его предшественнику ргМ. Получены оригинальные МКА, распознающие эпитопы белкаМ ВЗН. Показана возможность индуцирования вируснейтрализующих антител белком М ВЗН. Впервые описано наличие эпитопов со схожей структурой в пределах а. Е и белка М ВЗН. ВЗН с клеткой хозяина с помощью созданных МКА поможет найти новые подходы к предотвращению заболевания ЛЗН. Апробация работы и публикации. Международная конференция I i ii. Российская научная конференция с международным участием Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, Новосибирск, . По материалам диссертации опубликована статья. Данные получены лично автором и в соавторстве с к. Протопоповой Е. В., к. Терновым В. А., Ивановой , к. Качко , к. Иванисенко В. Рекомбинантные полипептиды , . Е2бмбб ргМ, имитируют соответствующие участки гликопротеина Е и белков М, ВЗН. Е ВЗН из семи типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка а. Е ВЗН из шести типов гибридом, синтезирующих видоспецифические МКА против участка 3. М ВЗН. Обнаружено различных антигенных детерминант в структуре белка Е ВЗН 6 эпитопов между а. Е ВЗН, 7 эпитопов в составе участка 0 6 а. Е ВЗН, включая индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Не менее четырех эпитопов в структуре участка а. М ВЗН.