Получение и исследование мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с аминокислотными заменами вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов

• Автор: Хмельницкая, Татьяна Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 93 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОТРОФНЫХ ПУРПУРНЫХ НЕСЕРНЫХ БАКТЕРИЙ

1.1.1. Филогения, морфология, метаболизм

1.1.2. Пигменты и фотосинтетеческие мембраны

1.1.3. Структура фотосинтетических комплексов ЯЬа. 8рЪаего1Ле

1.1.4. Первичные процессы фотосинтеза в реакционных центрах ИЬа. зрИаего1с1е

1.2 ГЕНЕТИКА БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

1.2.1. Структура фотосинтстичсского энного кластера и ргоперона ЯЬа. ршего

1.2.2. Регуляция фотосинтетических генов пурпурных бактерий

1.3. ОСНОВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БАКТЕРИ АЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

1.3.1. Генетические системы для направленного мутагенеза реакционных центров пурпурных бактерий
1.3.2. Методы генной инженерии, используемые для получения мутантных реакционных центров
1.3.3. Влияние аминокислотных замещений вблизи кофакторов переноса электрона на первичное разделение зарядов
в бактериальных реакционных центрах
1.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПЕРВИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННОМ ЦЕНТРЕ
1.4.1. Оптическая спектроскопия
1.4.2. Дифференциальная спектроскопия
1.4.3. Спектроскопия высокого временного разрешения
Стр.






ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МОЛЕКУЛЯРНОБИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2.1.1. Составление олигонуклеотидов для направленного мутагенеза
и М субъединиц РЦ . i
2.1.2. Методы направленного мутагенеза
2.1.3. Выращивание бактериальных штаммов
2.1.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК из клеток . i
2.1.5. Выделение тотальной ДНК из клеток . i
2.1.6. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.1.7. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
2.1.8. Препаративное выделение НК из геля
2.1.9. Приготовление вектора и фрагмен тов ДНК для лигирования
2.1 Лигирование вектора и фрагментов ДНК
2.1 Количественное определение ДИК в образце .
2.1 Получение компетентных клеток
2.1. Трансформация клеток .i. плазмидной ДНК
2.1 Конъюгативный перенос плазмид в . i
через . i
2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ . i
2.2.1. Получение хроматофоров
2.2.2. Очистка реакционных центров методом жидкостной хроматографии
2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ
2.3.1. Оптическая спектроскопия
2.3.2. Количественное определение содержания бактериохлоринов
2.3.3. Разделение пигментов экстрагированных из реакционных центров с помощью метода
2.3.4. Дифференциальная спектроскопия
2.3.5. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА . i
3.1.1. Конструирование плазмид, несущих отдельные участки оперона
3.1.2. Удаление из генов, кодирующих коровый светособирающий комплекс
3.1.3. Комплементация рчдефицитных штаммов . i плазмидой, содержащей полный риоиерон
3.1.4. Спектральные характеристики рекомбинантных штаммов . i
3.2. ВНЕСЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕЩЕНИЙ В и М СУБЪЕДИНИЦ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ . i
3.2.1. Составление олигонуклеотидов, использованных для мутагенеза
3.2.2.Мутагенез с помощью i i vi ii i
3.2.3. Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции
3.2.4. Схемы переклонирования мутантных фрагментов
3.2.5. Рестриктный анализ плазмид, несущих мутации вМ гене
3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ . i
3.3.1. Оптическая спектроскопия
3.3.2. Дифференциальная спектроскопия мутантных РЦМН
3.3.3. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения в исследовании мутанта М6Ш
3.3.4. Количественное определение содержания бактериохлоринов в I мутанта 6I
3.3.5. Разделение пигментов реакционных центров мутанта 6I с помощью метода




3.3.6. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения
в исследовании мутантов М0У1 и МУ
3.3.7. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения
в исследовании РЦ двойного мутанта МОУЬ М7РУ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 .Свойства новых мутантных РЦ с замещением МН
4.2. Свойства мутантных РЦ с замещением М ОУЬ и М0УУ
4.3.Свойства мутантных РЦ с замещением М0УЬМ7РУ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ГЛАВА 1. Структура фотосинтетических комплексов ЯЬа. Первичные процессы фотосинтеза в реакционных центрах ИЬа. Структура фотосинтстичсского энного кластера и ргоперона ЯЬа. Спектроскопия высокого временного разрешения
Стр. ГЛАВА 2. М субъединиц РЦ . Выделение и очистка плазмидной ДНК из клеток . Выделение тотальной ДНК из клеток . Количественное определение ДИК в образце . Трансформация клеток . Конъюгативный перенос плазмид в . ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ . Количественное определение содержания бактериохлоринов
2. ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА . Комплементация рчдефицитных штаммов . Спектральные характеристики рекомбинантных штаммов . ВНЕСЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕЩЕНИЙ В и М СУБЪЕДИНИЦ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ . ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ . Разделение пигментов реакционных центров мутанта 6I с помощью метода




3. ГЛАВА 4.