Физико-химические и кинетические свойства изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов голодающих крыс

• Автор: Косматых, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 149 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика изоформ малатдегидрогеназы

1.1.1 .Физиологическая роль малатдегидрогеназы в клетке

1.1.2. Внутриклеточное распределение изоформ малатдегидрогеназы

1.1.3.Физикохимические свойства изоформ малатдегидрогеназы

1.1.4. Кинетические свойства изофом малатдегидрогеназы

1.1.5. Регуляция функционирования малатдегидрогеназиой системы

1.1.5.1 .Аллостерические свойства малатдегидрогеназы

1.2. Изоферменты и пространственное разделение путей метаболизма

в животной клетке

1.3. Значение глиоксилатного цикла в поддержании внутриклеточного гомеостаза у живых организмов
1.3.1. Распространение и физиологическая роль глиоксилатного
цикла в микроорганизмах
1.3.2. Индукция глиоксилатного цикла у высших растений
1.3.3. Глиоксилатный цикл у низших животных
1.3.4. Трансформация липидов в углеводы в клетках высших
животных и человека
1.4. Механизмы адаптации животных к пищевой депривации
1.4.1 .Роль микротелец и лизосом в трансформации липидов в
углеводы в клетках млекопитающих
1.4.2. Биохимические сведения о конверсии жирных кислот в
углеводы в клетках высших животных
1.4.3. Гормональная регуляция энергетического метаболизма
у высших животных при пищевой депривации
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 .Цель и задачи
2.2.0бъекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования
2.2.2.1. Создание условий пищевой депривации
2.2.2.2. Приготовление ферментных препаратов различных
тканей и органов крыс
2.2.2.3. Выделение митохондриальной фракции гспатоцитов печени крыс
2.2.2.4. Определение активности ферментов
2.2.2.5. Определение содержания некоторых субстратов и промежуточных продуктов углеводного обмена в тканях и органах крыс
2.2.2.6. Определение количества белка
2.2.2.7. Методика хроматографического разделения изоформ МДГ
2.2.2.8. Электрофоретические исследования
2.2.2.9. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов
2.2.2 Определение молекулярной массы нативного фермента
2.2.2 Исследование кинетических характеристик и регуляции активности ферментов
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных
2.3. Полученные результаты и их обсуждение
2.3.1.Динамика содержания основных субстратов и промежуточных продуктов углеводного обмена в печени контрольных и голодающих крыс
2.3.2.Влияние пищевой депривации на активность некоторых ферментов основных метаболических путей в организме крыс
2.3.3.Действие голодания на активность ферментов метаболизма яблочной кислоты в органах крыс
2.3.4. Влияние пищевой депривации на активность МДГ в гепатоцитах голодающих крыс и ее изоферментный состав
2.3.5. Изучение субклеточной локализации различных изоформ МДГ в гепатоцитах голодающих крыс
2.3.6. Очистка изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов голодающих крыс
2.3.7. Физикохимические свойства изоформ МДГ из печени крыс
2.3.7.1.Изучение молекулярной массы и субъединичного строения изоформ малатдегидрогеназы из клеток печени крыс при голодании
2.3.8.Кинетические свойства и особенности регуляции изоформ МДГ
2.3.8.1 .Влияние концентрации оксатоацетата на активность изоформ малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс при голодании
2.3.8.2. Определение констант Михаэлиса различных изоформ МДГ из гепатоцитов крыс при голодании
2.3.8.3. Влияние концентрации ионов водорода на МДГ из гепатоцитов крыс при голодании
2.3.8.4. Влияние интермедиатов клеточного метаболизма на активность различных изоформ МДГ из клеток печени голодающих крыс
2.3.8.5.Влияние ионов на активность изоформ МДГ из гепатоцитов крыс
2.3.8.6.Влияние температуры на активность МДГ, выделенной из различных органоидов гепатоцитов голодающих крыс
2.3.8.6.1.Термостабильность изоформ МДГ из гепатоцитов крыс
2.3.8.6.2.Гемпературный оптимум изоформ МДГ из гепатоцитов крыс
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Диссертация изложена на 9 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 8 источников. Иллюстрационный материал включает рисунка, таблиц. ГЛАВА 1. Под малатдегидрогеназной активностью понимается ферментативное окисление малата в оксалоацетат или пируват, происходящее в присутствии НАД или НАДФ в качестве кофермента, и обратная реакция восстановления. В природе имеются три декарбоксилирующие малатдегидрогеназы МДГ, способные путем удаления молекулы СО2, в присутствии НАД или НАДФ, превращать оксалоацетат или малат в пируват. Кроме названия малатдегидрогеназы в литературе для их обозначения довольно часто используется термин маликэнзим. Главные отличия между маликэнзимами сводятся прежде всего к их распространению, субклеточной локализации, выполняемым функциям и специфичности по отношению к субстратам. НАД зависимая декарбоксилирующая МДГ К. Ф.1. НАД4 зависимая декарбоксилирующая МДГ К. Ф.1. Она способна превращать лишь малат в присутствии НАД и не воздействует на добавленный оксалоацетат. НАДФ зависимая декарбоксилирующая МДГ К. Ф. 1. В растительных клетках она обнаруживается в цитоплазме нефотосинтезирующих тканей или в хлоропластах листьев. Этот энзим способен декарбоксилировать малат или оксалоацетат и играет важную роль у С4растений в механизме фиксации и транспорта СО2 или в регенерации НАДФН для биосинтетических процессов. Дегидрогеназой, имеющей универсальное распространение в органическом мире и присутствующей в клетках всех живых организмов, от прокариот до многоклеточных эукариот . Иванищев, Курганов, i . Еиринцев, i, , , является НАД зависимая оксндорсдуктазная МДГ К. ФЛ. Обычно МДГ представлена в клетках различных организмов в виде множественных молекулярных форм, число которых варьирует в зависимости от групповой принадлежности живых существ, от образа их жизни и сложности метаболизма. В растительных и животных клетках фермент представлен различно локализованными изоферментами, выполняющими многочисленные функции. При переходе к эукариотическому типу организации происходит разделение отдельных метаболических процессов клетки, что ведет к возрастанию общего числа изоформ МДГ. В клетках низших эукариот, например, i i Ма, обнаруживаются два изоэнзима МДГ цитозольная и митохондриальная. Усложнение структуры и функций органов и способов размножения многоклеточных животных приводит к возрастанию генетической вариабельности изоэнзимного спектра МДГ , . МДГ, имеющие митохондриальную и цитоплазматическую локализации. Появление в клетках животных дополнительных изоформ МДГ, выражает, повидимому, существование определенного механизма адаптации к изменениям среды Манченко, , который даст им возможность обладать достаточной пластичностью для выживания. При этом синтез отдельных изоформ МДГ может осуществляться только на определенных этапах онтогенетического развития организма или при специфичных изменениях условий среды. У растений также обнаруживаются генетический полиморфизм, изменчивость, видовая и тканевая специфичность изоферментного спектра МДГ. В клетках растений могут быть обнаружены изоэнзимы МДГ, имеющие цитоплазматическую, митохондриальную, пластидную, глиоксисомальную, пероксисомальную или клеточностеночную локализацию vi, , Пинеру и др, . Кроме того, некоторые из этих изоэнзимов могут быть представлены несколькими молекулярными формами. Использование метода изоэлектрофокусирования позволяет обнаружить у кукурузы 9 изоформ МДГ, у растений из рода астр i 8, а у представителей родов Vii , боб конский i,. Одной из особенностей растительной клетки является наличие определенного набора органелл хлоропластов, глиоксисом, пероксисом, выполняющих специфические метаболические функции. В настоящее время в каждой из этих органелл установлено присутствие изоэнзимов МДГ i, , , . Вторая особенность метаболизма растительной клетки связана с тем, что в ней существует определенное динамическое равновесие между катаболическими и анаболическими процессами.