Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК

• Автор: Баранова, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Многоуровневая система

биорегуляции.

1.2. Рибонуклеиновые кислоты в регуляции процессов па уровне целостного организма

1.2.1. Рибонуклеиновые кислоты в системе биорегуляции

1.2.2. Рибонуклеиновые кислоты как модуляторы иммунного ответа

1.2.3. Влияние экзогенных РНК на фенотипические свойства лимфоидных клеток

1.3. Рибонуклеиновые кислоты в регуляции внутриклеточных процессов.

1.3.1. Влияние нмРНП на основные процессы, происходящие в клетке

1.3.2. РНКРНК взаимодействия и общность процессов эндонуклеотического расщепления РНК.
1.4. Роль эндонуклеотического расщепления высокомолекулярных цРНК.
1.4.1. Расщепление 3р К при аутоиммунной патологии
1.4.2. Фрагментация 3 р К в модельных системах при апоптозе
1.4.2.1.В клетках перепой системы
1.4.2.2. В опухолевых клетках
1.4.3. Иные случаи фрагментации 3рРНК.
1.5. Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Фенольный метод выделения РНК.
2.1.1. Получение препаратов РНК из печени мышей
2.1.2. Получение препаратов РНК из тимуса телнка и тимуса крыс
2.1.3. Получение препаратов РНК из клеток АКЭ
2.1.4. Дополнительная очистка препаратов РНК.
2.2. Детергентый метод получения РНК из тимуса крупного рогатого скота
2.3. Очистка препаратов РНК
2.4. Определение количества РНК
2.5. Автолитическая деградация РНК
2.6. Определение количества РНК, ДНК и ненуклеиновых примесей в полученных препаратах
2.7. Элекгрофорез препаратов РНК.
2.7.1. Препаративный электрофорез
2.7.2. Приготовление образцов РНК
2.7.3Аналитический электрофорез.
2.8. Изоэлектрофокусирование препаратов Р1К
2.9. Гельхроматография препарата Рнботим.
2 Специфическая фрагментация нуклеиновых кислот при апоптозе.
.Культивирование клеток.
.Метод выделения ДНК из культур клеток
.Определение фрагментации Д1Кпри помощи окраски
дифиналамином
.Метод выделения РНК из культур клеток
2 Определение биологической активности препаратов методом локального гемолиза метод Ерне.
2 Исследование влияния препарата Риботим на репаративные процессы в коже
2 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты собственных исследований .
3.1. Разработка методов выделения РНК из тимуса.
3.1.1. Фенольный метод выделения РК.
3.1.2. Детергентный метод выделения РНК.
3.2. Физнко химическая характеристика препаратов РНК из тимуса.
3.2.1. Оценка степени очистки препаратов
3.2.2. Определение содержания РНК, ДНК и белка в полученных препаратах РНК
3.2.3. Исследование препаратов РНК при помощи электрофореза в ПАЛ Гг различной процентной концентрации
3.2.3.1.Исследование препаратов РНК с помощью ЭФ в 2,5ом ПААе в денатурирующих условиях
3.2.3.2. Исследование препаратов РКс помощью ЭФ в 8ом ПААГе в денатурирующих условиях
3.2.3.3. Фрагментация высокомолекулярных образцов цРНК при автолизе.
3.2.3.4. Исследование препаратов РНК с помощью ЭФ ПААГ0,2 ДДСКа в денатурирующих условиях
3.2.4. Специфическая фрагментация нуклеиновых кислот при апоптозе.
3.2.4.1. Тестирование мсжнуклеосомной деградации ДНК в лимфолейкозных клетках.
3.2.4.2. Определение уровня межнуклеосомной деградации ДНК с использованием окрашивания дефиниламином.
3.2.4.3. Фрагментация высокомолекулярной РНК в лимфолейкозных клетках при действии индукторов кеточной гибели.
. Иммунобиологичсская характеристика препаратов РНК из тимуса.
3.3.1. Характеристика препарата Рибопиш при помощи метода Т .
зависимого антителообразования метод Ерне
3.3.2. Исследование влияния препарата Риботим на репаративные
процессы в коже.
Глава 4. Обсуждения результатов
4.1. Фрагментация высокополимерной РНК при выделении
4.2. Фрагментация цРНК в модельных системах в условиях автолиза и при апоптозе клеток.
4.3. Сравнительный анализ продуктов фрагментации.
4.4. Возможная биологическая роль получающихся фрагментов.
Список литературы.
Список сокращений, используемых в работе.
РНК рибонуклеиновая кислота.
цРНК цитоплазматическая рибонуклеиновая кислота.
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота.
нмРНК низкомолекулярная рибонуклеиновая кислота.
рРНК рибосомная рибонуклеиновая кислота.
РНП рибонуклеопротеид.
РНКаза рибонуклеаза.
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота.
АКЭ асцитная карцинома Эрлиха.
ДДСИа додецилсульфат натрия.
ЭФ электрофорез.
ПААТ полиакриламидный гель.
РТ Риботим.
НИ нуклеинат натрия.
АОК антителообразующие клетки.
КРС крупный рогатый скот ЦГИ циклогексимид
Введение.
Актуальность


РНК в процессе экстракции из ткани, в модельных эксперимента, i vi и при индукции автолиза, а также охарактеризовать получающиеся фрагменты. Провести исследования иммунобиологических свойств низкомолекулярных РНК из тимуса для выявления специфической активности потенциального фармпрепарата Риботим РТ, содержащих эти РНК. Научная новизна. Предложены новые экспериментальные подходы для экстракции РНК с учетом специфики тимусной ткани. Оценены величины молекулярных масс всех компонентов рибонуклеиновых препаратов из тимуса. Впервые охарактеризованы как нативные препараты цРНК, так и препараты с разным уровнем фрагментации высокомолекулярных зрелых молекул РНК. Исследован и проанализирован процесс автолиза цРНК в сравнении с данными по фрагментации высокомолекулярных зрелых молекул РНК при апоптозе лимфолейкозных клеток. В качестве основы для создания нового фармпрепарата предложен биоаюнвный рибонуклеиновый препарат из тимуса Риботим, обладающий иммунотропными и регенерирующими свойствами. Практическая значимость работы. Обнаружение иммунобиологической активности тимусных РНК и в первую очередь нмРНК потребовало разработки нового технологичного метода их выделения. На этот способ получено положительное решение от . ВНИИГПЭ на Средство Риботим, обладающее иммунотропным действием и способ его получения. В рамках требований Фарм комитета по преклиническим испытаниям проведено исследование специфической активности данного препарата. Показано влияние РТ на Т зависимое антителообразование и репаративные процессы в коже в моделях экспериментальной раны и ожога у крыс. Эти результаты, наряду с отсутствием острой токсичности при дозе, десятикратно превышающей терапевтическую, позволяют продолжить преклинические испытания РТ. Проведенная в настоящей работе физикохимическая характеристика позволила получать тимусные рибонуклеиновые препараты определенного состава и тем самым стандартизовать наработку РТ. В то же время, обнаруженная взаимосвязь между составом и биологической активностью дает возможность поновому трактовать те биологические эффекты, которые вызывают уже известные препараты экзогенных РНК. Положения, выносимые на защиту. Состав препаратов РНК из тимуса крыс, в основном, соответствует аналогичным препаратам из других животных клеток, в частности, из клеток печени и АКЭ мышей. В то же время высокомолекулярные РНК из тимуса в большей степени подвержены специфической фрагментации, которая может проявляться уже в процессе экстракции РНК из ткани. Наблюдаемая фрагментация с различной степенью выраженности происходит воспроизводимым и специфическим образом также в модельных экспериментах автолиза и в условиях индуцированного апоптоза клеток. Фрагментация высокомолекулярных цРНК протекает как многоступенчатый каскадный процесс, который по последовательности этапов и спектрам получающихся фрагментов носит сходный характер при всех исследованных условиях. РНК из тимуса Риботиме является результатом многоступенчатой специфической фрагментации более высокомолекулярных цРНК. Наблюдаемый ограниченный эндонуклеолиз, повидимому, имеет биологический смысл, а образующиеся фрагменты проявляют иммунобиологическую активность. Обнаруженные иммунобиологические свойства Риботима позволяют предложить его в качестве потенциального лекарственного средства со специфической активностью иммунотропного препарата, усиливающего репаративные процессы в коже. Апробация работы. Ном Российском конгрессе Человек и лекарство, Москва, Уой научной конференции Дни иммунологии в СанктПетербурге, СПетербург, У1ой Всероссийской конференции Дни иммунологии в СанкПетербурге, СПетербург, , УПом Всероссийском нучном форуме с международным участием им. В.И. Иоффе Дни иммунологии в СанкПетербурге, СПетербург, . Публикации. Структура и объм диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 6 страниц машинописного текста, таблиц и рисунков.