Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на трансгенных мышах и трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9

• Автор: Сучкова, Ирина Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 138 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура, особенности и функции сателлитных ДНК различного типа

1.1.1. Микросателлитная ДНК

1.1.2. Минисателлитная ДНК И

1.1.3. Сателлитная ДНК .

1.2. Молекулярные механизмы нестабильности сателлитных ДНК и период возникновения данного явления в онтогенезе.

1.3. Метилирование ДНК и нестабильность повторяющихся последовательностей

1.4. Использование трансгенных животных в экспериментах по изучению i viv различных типов сателлитных ДНК

1.4.1. Трансгеноз как один из методов биологических исследований.

1.4.2. Исследование природы и функций сателлитных ДНК с помощью трансгеноза
ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клонирование 3,8 т.п.н. фрагмента сателлитной ДЫК1V
2.1.1. Трансформация . i.
2.1.2. Выделение 3,8 т.п.н. вставки из плазмиды 2.
2.2. Получение трансгенных животных
2.3. Трансфекция клеток эмбриональной терагокарциномы мыши линии 9
2.4. Выделение геномной ДНК
2.5. Полимеразная цепная реакция.
2.5.1. ПЦР i vi.,
2.5.2. ПЦР i i.
2.6. Определение паттерна метилирования экзогенной ДНК.
2.7. Флуоресцентная гибридизация i i I. .
2.8. Статистическая обработка данных.
2.9. Компьютерный анализ
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности повторяющейся единицы сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота
3.2.Скрининг и анализ мышей, трансгенных по сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота.
3.2.1. Результаты скрининга трансгенных животных
3.2.2. Анализ межгенерационной нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК
3.2.3. Анализ паттерна метилирования экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.
3.3. Молекулярногенетические исследования трансфектных клеток мышиной эмбриональной тсратокарциномы 9.
3.3.1. Анализ соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках 9.
3.3.2. Анализ паттерна метилирования чужеродной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках 9.
3.3.3. Результаты гибридизации i i .
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1.Причины выбора для исследования механизмов нестабильности минисателлитов
3,8 т.п.н. фрагмента сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота
4.2.Межгенерационная нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.
4.2.1. Причины отсутствия продуктов ГИДР амплификации у трансгенных мышей
4.2.2. Предполагаемые механизмы нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.
4.2.3. Исследование паттерна метилирования фрагмента экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.
4.2.4. Причины фенотипического проявления межгенерационной нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей
4.3.Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных
клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии Р9.
4.3.1.Возможные механизмы соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках Р9
4.3.2. Анализ паттерна метилирования фрагмента экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках 9
4.3.3. Влияние соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на
жизнеспособность трансфектных клеток Р9.
4.4. Период образования нестабильности экзогенной сателлитной ДНК в онтогенезе.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возможно, это было обусловлено неудачным выбором авторами типа минисателлита, а именно его состава и размера, либо тем, чю они не проводили анализ потомства трансгенных животных на эмбриональных стадиях развития, когда могли быть зарегистрированы изменения в нуклеотидной последовательности грансгена. Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение механизмов нестабильности минисателлитной ДНК у трансгенных мышей и в фансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши 9. Получить трансгенных мышей и трансфертные клетки эмбриональной тератокарциномы мыши 9, несущих в своем геноме 3,8 т. ДНКIV крупного рогатого скота. Провести компьютерный анализ нуклеотидной последовательности фрагмента для оценки возможного влияния горячих точек рекомбинации и вторичных структур ДНК на нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК. Выяснить, существует ли взаимосвязь между нестабильностью чужеродной минисателлитной ДНК и се метилированием. Определить характер влияния нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на жизнеспособность трансгенных мышей и фансфектных клеток 9. Сравнить влияние вторичных структур ДНК, горячих точек рекомбинации и метилирования ДНК на межгенерационную и соматическую нестабильность чужеродной минисателлитной ДНК у фансгенных мышей и трансфектных клеток эмбриональной тератокарциномы мыши 9. ГЛАВА . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структура, особенности и функиии сателлитных ДНК различного типа. В геноме живых организмов, не зависимо от их принадлежности к определенным таксономическим группам, определенную долю занимают повторяющиеся последовательности, которые могут быть идентичными, либо иметь несколько измененный нуклеотидный состав. Повторы могут быть представлены копиями относительно длинных последовательностей, диспергированных по всему геному, либо образовывать кластеры тандемно повторяющихся единиц относительно простого нуклеотидного состава, причем количество копий повторов может варьировать от двух до нескольких миллионов. К последней группе принадлежат сателлитные ДНК, которые в зависимости от длины и нуклеотидного состава повторяющейся единицы, а также от общего размера кластера, классифицируют на несколько типов сателлитных ДНК микросателлиты, минисателлиты и собственно сателдитную ДНК, в которой, в свою очередь, некоторые авторы выделяют мидисателлиты я макросателлиты . V, , , . Микросателлитная ДНК К микросателлитным последовательностям принято относить простые тандемные повторы ПТП с повторяющейся единицей до 5 п. V, , , . Предполагают, что один ПТП приходится на каждые т. ДИК . В настоящий момент, например, в геноме человека идентифицировано более микросателлитных локусов i . У животных наиболее распространенными из ПТП являются динуклеотидиые повторы обычно не превышающие п. ПГП чаще всего локализуются в 5, 3нетранслируемых районах, интронах и намного реже в экзонах. В последних предпочтительно встречается повторы, кодирующие полиглутаминовые тракты табл. Например, повторяющиеся последовательности есть в гене ТАТА связывающего белка ТВР, гомеозисных генах у дрозофилы цит. Нох . Микросателлитные локусы идентифицированы в шестом ингроне гена повтор , ассоциированного с лейкемией, и динуклеотидный повтор в 5фланкирующем районе этого гена приблизительно в 2 т. Обнаружены , САп микросателлитные повторы в третьем интроне гена каппаказеина крупного рогатого скота vi . ПТП также были выявлены у бактерий, например, у i i повтор СААТ присутствует в 5конце генов, кодирующих гликозил трансферазу i, . Характерной особенностью большинства ПТП является их внутрипопуляционный полиморфизм, обусловленный природной нестабильностью таких последовательностей, причем нестабильность таких повторов коррелирует с общей длиной тандема i . Однако следует подчеркнуть, что не все ПТП являются полиморфными. Гак, например, несколько микросатсллитных локусов хромосомы человека имели уровень полиморфизма, сопоставимый с таковым аутосомных генов Степанов, Пузырев, . Кроме того, повтор первого экзона гена адренорецептора АТСТп те грану клеотидный повтор интрона гена фактора свертываемости крови фон Виллебранда V и анонимная ДНКпоследовательность короткого плеча Xхромосомы человека X1 спонтанно изменялись сравнительно редко, даже у лиц, проживавших в экологически неблагоприятных условиях Скакун и др.