Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего

• Автор: Акифьев, Борис Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 105 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Аполилопротеин л1 человека структурнофункциональная

ОРГАНИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА.

2.2. Структурнофункциональная организация гена аро ЛI человека.

2.3. Методы доставки генов в клетки млекопитающих.

2.3.1. Перенос ДНК i vi перенос в культуру клеток.

2.3.1.1 Кальцийфосфатная преципитация

2.3.1.2 Лнпофскция

2.3.1.3 Электропорация

2.3.1.4 Применение молекулярных конъюгатов

2.3.1.5 Перенос генов с помощью рекомбинантных вирусов
2.3.2. Перенос еviv
2.3.3. Перенос генов i viv
2.3.3.1 Перенос с помощью рекомбинантных вирусов
2.3.3.2 Использование для доставки генов i viv липофекции.
2.3.3.3 Перенос генов в составе комплексов с поликатионами иди с конъюгатами поликатионов и лигандов клеточных рецепторов
2.3.3.4 Инъекции и иные физикохимические способы доставки ДНК в организм
2.3.3.5 Доставка ДНК в организм животного методом гидродинамических внутривенных инъекций.
2.4.Разработка методов генотерапии гиперхолестеринемии и атеросклероза на основе доставки гена аро АI в организм
млекопитающего
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Материалы и объекты исследований.
3.2. Синтез галактозилированного полиЬлизина
3.3. Трансформация бактериальных клеток, накопление и очистка плазмид, мечение препаратов ДНК.
3.4. Образование комплексов ДНК галдктозилированный полиЬлизин
3.5. Трансфекция культивированных клеток и анализ экспрессии
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВМАРКЕРОВ В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ
3.6. Измерения активности люцифердзы.
3.7. Конкурентное вытеснение адсорбированных на клеточной
ПОВЕРХНОСТИ МЕЧЕНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК РОЕУЬУБЭОАЕ ИЗБЫТКАМИ НЕМЕЧЕНОГО КОНЪЮГАТА.
3.8. Внутривенные инъекции комплексов ДНК роьуЬЬубОаь в хвостовую ВЕНУ крысам
3.9. Внутривенные инъекции плазмидной ДНК в хвостовую вену мышам
3 Выделение ДНК из тканей животного и анализ чужеродных нуклеотидных последовательностей в составе ДНК КРЫС и мышей, ПЦР
3 Выделение РНК и ретроПЦР.
3Спасение плазмидных ДНК из ядер клеток печени мышей
3 Определение в сыворотке крови мышей и крыс человеческого аро А1 и антител, специфичных к аро А1 человека.
3 Статистическая обработка полученных результатов.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Использование для доставки ДНК в клетки
ГЕПАТ ТАРНОГО РЯДА
4.1.1. Поиск оптимальной величины соотношения конъюгатДНК формирование комплексов для трансфекции клеток и инъецирования
4.1.2. Трансфекция культивируемых гепатомных клеток комплексами ДИК галактозилированный полиЬлизип.
4.1.3. Определение оптимальной величины ионной силы в реакционной среде при образовании комплексов ДНК
4.1.4. Анализ специфичности связывания комплексов ДНК асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток 2.
4.1.5. Доставка гена аролипопротеина А1 человека в комплексе с гапактозилированным поли лизином в печень крыс.
4.1.6. Вектор экспрессии гена аро АI человека сохраняется в ядрах клеток печени в виде эписомы
4.2. Использование лизинбогатых и аргининбогатых пептидов для доставки ДНК В КЛЕТКИ млекопитающих.
4.3. Экспрессия гена аро А1 человека в печени после доставки его мышам методом внутривенных гидродинамических инъекций.
4.3.1. Влияние комтексообразования ДНК с катионными пептидами на эффективность гидродинамического переноса.
4.3.2. Сравнение характера экспрессии гена аро А1 в зависимости от интронноэкзонной структуры.
4.3.3. Оценка эффективности экспрессии гена люциферазы под контролем гепацитарного энхансера аро А1 в переживающих клетках печени мышеи.
4.3.4. Анализ присутствия гена аро А1 в ядерной низкомолекулярной ДНК клеток печени мышей.
4.3.5. Оценка гуморального иммунного ответа у мышей на введение плазмиды рЛ.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
6. ВЫВОДЫ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Цель работы сравнить различные невирусные способы переноса гена аролипопротеина АI человека в клетки млекопитающих i vi и i viv и изучить особенности экспрессии гена аро ЛI человека в чужеродном окружении в зависимости от его структурнофункциональной организации. Перенос плазмидиой ДНК в полиэлектролитном комплексе с галактозилированным полиЬлизином ро1уЬ1узСа1 в культивируемые клетки гепатомы человека Нер происходит рецепторопосрсдованным эндоцитозом. Эффективность доставки плазмидных векторов экспрессии в комплексе с роуЫуьОа1 в культивируемые клетки гепатомы человека НерС2 сравнима с эффективностью доставки плазмидных ДНК методом кальцийфосфатной копреципитации и зависит от молярного соотношения ДНК роуЬ1узОа1 в комплексе. Плазмидный вектор экспрессии кДНК аро А1 человека, инъецированный в комплексе с ро1уЬ1у5Оа1 в хвостовую вену крыс, доставляется в клетки печени и сохраняется в ядрах клеток в виде эписомы по меньшей мере в течение недели. Уровень аро А1 человека в крови крыс может быть повышен путм повторных внутривенных инъекций указанных комплексов. Доставка векторов экспрессии гена аро Л1 человека в печень мышей СВ путм гидродинамических внутривенных инъекций соответствующих плазмидных ДНК обеспечивает высокое содержание человеческого аро А1 в сыворотке крови животных. Уровень аро А1 человека в крови мышей может быть повышен повторными внутривенными инъекциями плазмидиой ДНК. Гидродинамическое введение комплексов ДНК с катионным пептидом ТаХ приводит к резкому падению эффективности переноса по сравнению с введением голой ДНК. Человеческий белок аро А1 спустя 2 недели после инъекций гена мышам не стимулировал появления специфичных антител в крови животных. Динамика экспрессии гена аро А1 человека в печени мышей не зависит от типа промотора, а определяется организацией структурной части гена. Сохранение экзонноинтронной структуры гена аро Л1 обеспечивает эффективную и более продолжительную до б месяцев в сравнении с его кДНКкопией экспрессию гена. Вместе с тем, отрицательные данные, полученные по доставке
геновмаркеров и гена аро Л1 человека в комплексе с модифицированными пептидами в организм путм внутривенных инъекций комплексов, указывают на существование определенных факторов, ограничивающих использование этого способа для практических задач гемотерапии атеросклероза. Более перспективным является способ гидродинамических инъекций голой ДНК, который может быть адаптирован для целей генотерапии атеросклероза в дальнейшем. Весьма важно в каждом конкретном случае учитывать также сгрукт урн офункциональную организацию доставляемого в организм гена. В нашем случае важным для продолжительной и эффективной экспрессии оказалось сохранение экзонноинтронной структуры гена аро Л1 человека. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проекта, направленного на лечение атеросклероза путем генетической коррекции соотношения антиатсрогенных и атерогенных липопротсидов в крови больного за счт доставки вектора экспрессии гена аро Лв печень больного. Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров кафедр эмбриологии и биохимии СанктПетербургского государственного университета. Впервые была показана возможность доставки векторов экспрессии гена аро Л1 человека в организм млекопитающего путм внутривенных инъекций комплексов плазмидной ДНК с ро1уЬ1узСа1, причем было установлен факт продолжительного сохранения доставленной ДНК в клетках печени в виде эписомы. В результате гидродинамических внутривенных инъекций плазмидных векторов экспрессии гена аро Л1 человека мышам СВ оказалось возможным получить длительную и эффективную экспрессию перенеснного гена в клетках печени, а за счт повторных инъекций добиться повышения уровня аро А1 человека в крови животных. Продолжительность и уровень экспрессии гена аро Л1 человека в клетках печени мышей в чужеродном окружении в значительной мере определяется НС видом промотора вирусоспецифический или собственный, а экзонноинтронной структурой кодирующей части гена, что является абсолютно новым фактом, имеющим приоритетное значение.