Молекулярные основы контроля нереста берегового краба Sesarma Haematocheir : Brachyura: Grapsidae

• Автор: Гусев, Олег Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.08
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные типы биологических ритмов и систем их контроля

1.1.1. Осциллятор и наблюдаемые ритмы.

1.1.2. Кривая подстройки фазы почему она важна

1.1.3.Генетический анализ циркадианного осциллятора

9 1.1.4. Околоприливный осциллятор

1.2. Основные черты экологии и биологии размножения береговых крабов рода .

1.2.1. Репродуктивная система береговых крабов

1.2.2. Синхронизация нереста крабов с циклами внешней

среды.
1.2.3. Синхронизация хатчинга эмбрионов.
1.3. Нерестовые протеиназы структура и биологические
функции
1.4. Белки теплового шока и их роль в эмбриогенезе
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Животные и микроорганизмы для экспериментов
2.2. Реактивы и среды.
2.3. Очистка протеиназы хроматографическими методами
2.4. Электрофорез белков
2.5. Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующихся
в программе нереста крабов
2.6. Скрининг библиотеки кДНК и клонирование гена,
кодирующего
2.7. Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Выделение и очистка нерестовой протеиназы.
3.1.1. Биологическая активность .
3.1.2. Очистка и выделение нерестовой протеиназы методами хроматографии
3.1.3. Устойчивость биологической активности
3.1.4. Реципрокный анализ эффекта нерестовой воды береговых крабов
3.1.5. Очистка ОН методом КРНРЬС.
3.1.6. Частичное аминокислотное сиквенирование ОНЗБ
3.1.7. Клонирование гена кодирующего ОН.
3.1.8. Анализ аминокислотной последовательности ОННБ
3.1.9. Поиск последовательностей, гомологичных гену ОНББ с использованием базы данных международного
ф банка генов
3.1 Анализ структуры гена кодирующего ОН и его активности
3.1 Пострансляционная модификация и активация ОН .
3.1 Использование поликлональных антител для детекции ОН в тотальном белке эмбрионов
3.1 Посттранскрипционные изменения в структуре мРНК кодирующей ОН и множественность локусов гена
3.1 Морфологические изменения в абдоменальных волоска под дейтвием ОН.
3.1 Межвидовые различия в структуре ОН
3.2. Инициация хатчинга эмбрионов в лаборатории и применение
вычитающей гибридизации на модели программы нереста
крабов
3.2.1. Инициация хатчинга эмбрионов эффект органических соединений
3.2.2. Поиск генов специфичных для программы хатчинга с использованием вычитающей гибридизации
3.2.3. Анализ экспрессии и структуры гена
кодирующего Н8Р.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Выделить соединения, являющиеся аналогами или гомологами нерестовых ферментов у крабов и участвующие в частичном или полном растворении яйцевых оболочек, которое является условием успешного хатчинга. Научная новизна. Идентифицирована и выделена новая сериновая протеиназа, а также клонирован кодирующий ее ген. Наличие такого фермента является эволюционным преимуществом крабов, так как позволяет начинать инкубацию новой партии икры без линьки, тогда как для других десятиногих раков линька является необходимым условием очистки плеопод и подготовки для новой инкубации яиц. В ходе экспериментов по сравнению библиотек генов, экспрессирующихся в эмбрионах на разных этапах хатчингпрограммы, методом супрсссионной вычитающей гибридизации был идентифицирован и клонирован новый ген, по структуре схожий с генами кодирующими белки теплового шока Н5Р. Показано, что экспрессия этого гена многократно усиливается в эмбрионах, находящихся в хатчингпрограмме. Предложена гипотеза о возможной схеме участия стрессовых белков в инициации программы хатчинга в эмбрионах крабов Огарзккяе. Установлена возможность искусственной инициации хатчинга эмбрионов при воздействии ряда химических веществ. В этом случае хатчинг также был высоко синхронизирован среди эмбрионов. Проведен сравнительный анализ возможности изменения временного механизма в эмбрионах крабов и полученных ранее данных о структуре захватывания ритмов активности некоторых видов обитателей беломорской литорали. Практическая значимость уаботы. Один из ключевых моментов в этом направлении эффективный мониторинг и возможность контроля репродуктивных циклов промысловых видов этой группы. Данное исследование является первой попыткой выявления молекулярных механизмов временной упорядоченности выклева эмбрионов крабов и сопутствующих ему морфологических изменений. Апробация работы. Ежегодных заседаниях Японского общества эмбриологии членистоногих Сунадайра, Итако, на XIX Международном генетическом конгрессе Мельбурн, Австралия, , на итоговых научных конференциях Казанского университета в , , на международной конференции Геон Казань, , на XIX Международном зоологическом конгрессе Пекин, Китай, . Заявлено участие в Международном научном семинаре Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов Мурманск, 24 ноября . Публикации. По теме настоящей диссертации опубликовано научных работ в зарубежных журналах и изданиях трудов российских и зарубежных конференций. Частичное растворение яйцевых оболочек при нересте крабов происходит при участии сериновой протеиназы пострансляционно принимающей двухдоменную форму. Протеиназа обладает высокой стрессовой устойчивостью и является первым выделенным представителем нерестовых протеиназ в ракообразных. Выклев эмбрионов крабов может быть направленно инициирован кратковременным воздействием растворов ряда кетонов. Инициация выклева хатчинга эмбрионов крабов происходит при участии стрессового белка НБР, экспрессия которого в развивающихся эмбрионах многократно возрастает за часов до хатчинга. Ритмичность одна из кардинальных закономерностей мироздания. В том числе живой природе ритмичность присуща неотъемлемо. Ритмы пронизывают и упорядочивают все проявления жизни. До недавнего времени естественно было полагать, что ритмы островки закономерности, предсказуемости в морс стихийности, случайности. Биологические ритмы многообразны и вездесущи, охватывают все уровни организации жизни от клеточного до популяционного. Так называемые физиологические ритмы рабочие циклы функционирования клеток, органов и систем организма представляют собой способ реализации соответствующих физиологических функций. Между тем, существует особый класс биологических ритмов циркаритмы, и, прежде всего, наиболее изученные из них циркадианные ритмы, природа которых совершенно иная. В данной главе мы приводим обзор работ и представлений о циркадианном осцилляторе, как базовом для понимания характеристик околоприливной ритмичности поведения, т.