Изучение структуры и функции митохондриальной АТФазы с помощью методов ЭПР

• Автор: Имедидзе, Эльдар Адамович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.

Глава I. Структура растворимой АТФазы и функции ее

субъединиц .

1. Субъединичный состав растворимой АТФазы

2. Нуклеотидсвязывающие центры АТФазы и их функции . .

3. Функциональные группы нуклеотидсвязывающих

центров митохондриальной АТФазы .

4. Конформационные изменения АТФазы

Глава П. Структура и функции АТФазного комплекса

митохондрий
1. Мембранные компоненты АТФазного комплекса митохондрий и их функции .
2. Локализация фактора в митохондриальной
мембране.
Глава Ш. Методы измерения мембранного потенциала .
I. Методы измерения электрического потенциала
1. Прямые методы измерения электрического
потенциала.
2. Методы определения АШ , основанные на измерении равновесного распределения пробных зарядов .
3. Метод липидорастворимых проникающих ионов .
4. Измерение трансмембранного электрического
потенциала с помощью флуоресцентных зондов
2. Методы измерения градиента на сопрягающих
мембранах .
I. Титрометрический метод
стр.
2. Распределение проникающих кислот
3. Измерение ДрН с помощью флуоресцентных и
спиновых зондов .
Глава 1У. Материалы и методы
Препаративные методы
1. Выделение митохондрий из сердца быка.
2. Выделение субмитохондриальных частиц СМЧ
3. Выделение марганцевых субмитохондриальных
частиц.
4. Выделение субмитохондриальных частиц, лишенных
фактора .
0. Выделение водорастворимой АТФазы фактор
6. Реконструкция фактора р с мембраной СМЧ.
7. Модификация фактора с профлавином
8. Модификация фактора р1 спиновыми метками .
Аналитические методы
1. Определение концентрации белка .
2. Определение АТФазной активности фактора р1 и субмитохондриальных частиц .
3. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих реагентов .
4. Измерение спектров флуоресценции профлавина
5. Измерение электрического потенциала ДУ с
помощью проникающих анионов .
6. Измерение спектров Электронного Парамагнитного Резонанса ЭПР
стр.
Глава У. Модификация митохондриального фактора
спиновыми метками и разделение модифицированного
фермента на субъединицы .
Глава У. Локализация фактора в митохондриальной
мембране.
Глава УП. Измерение градиента на мембране субмитохондриальных частиц
Выводы III
Литература


Кроме того, предложенная система МпСМЧ субмитохондриальные частицы с высоким содержанием ионов марганца во внутреннем объеме может быть использована для изучения механизма транслокации различных анионов и катионов через митохондриальную мембрану. Полученные данные существенно расширяют имеющиеся представления о структуре АТФазного комплекса и должны быть учтены при формулировании принципов функционирования АТФазного комплекса. ГЛАВА I. Растворимая АТФаза сопрягающий фактор это водорастворимый компонент АТФазного комплекса, способный катализировать реакцию гидролиза АТФ до АДФ и неорганического фосфата. i i , ,, , , , , , V, , , . электрофореза составляют 00 о 00 У II 5 0 iii, . Для фактора из бактерий Еi определена аминокислотная последовательность всех субъединиц И вычислены ИХ точные молекулярные веса . Вопрос о стехиометрии субъединиц в факторе до последнего времени оставался открытым. Большинство исследователей на основании данных электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия предполагали следующий состав субъединиц фактора еда , , , , i, . Ж Время, ряд данных указывал на стехиометрию Так, Слейтер с сотр. З субъединицей, образует с фактором комплекс в соотношении два моля ингибитора на моль фермента. . В ряде независимых работ было показано, что фермент имеет шесть центров связывания нуклеотидов, ПО одному на каждую большую субъединицу v . , ii, . Результаты, полученные при изучении связывания ауровертина и других ингибиторов, объясняются, повидимому, тем, что одинаковые субъединицы могут находиться в различных конформационных состояниях в молекуле фактора . Так, например, одна из трех 3 субъединиц может быть не способной связывать ауровсртин. По данным некоторых авторов стехиометрия субъединиц в факторе из хлоропластов, определенная различными методами, описывается формулой , i . тоже содержит Зо и 3 i . . Установлен также субъединичный состав фактора из термофильных бактерий р3 садуив i , . Если вопрос о субъединичном составе водорастворимой митохондриальной АТФазы можно считать решенным, то расположение субъединиц относительно друг друга в молекуле фермента до сих пор не выяснено. Определенные успехи в изучении этого вопроса были достигнуты в работах по сшиванию субъединиц фактора бифункциональными реагентами. С помощью различных сшивающих реагентов было установлено, что в митохондриальном факторе преимущественно образуются димеры и о , . , 6и , а димеры и отсутствовали. Таким образом, наиболее вероятным представляется поочередное расположение крупных субъединиц и локализация комплекса минорных субъединиц в центре молекулы фермента. Данные электронной микроскопии по исследованию фактора из митохондрий и бактерий свидетельствуют о наличии в молекуле фермента 67 глобул диаметром около а. Шесть глобул расположены на вершинах правильного шестиугольника, а седьмая В центре i , , . Сходные результаты были получены при рентгеноструктурном анализе кристаллов фактора ИЗ термофильной бактерии i , . Получены также данные о структуре кристаллов фактора из митохондрий печени крысы, однако, разрешение, достигнутое в этих опытах, не позволяет делать однозначные выводы о структуре фермента 1 . Результаты, указывающие на двуслойную структуру фактора из различных объектов, были получены в группе И. А. Козлова Цупрун И др. , 8V. ИЗ бактерий i , , а, . Авторам удалось с помощью методов генной инженерии клонировать гены, кодирующие синтез всех белков АТФазного комплекса i и определить В НИХ последовательность нуклеотидов , . Анализ аминокислотных последовательностей фактора убедительно показал высокую степень ГОМОЛОГИИ и р субъединиц , i, , что указывает на существование их общего ЭВОЛЮЦИОННОГО предшественника , .