Роль субдомена инозин-5-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов

• Автор: Пимкин, Максим Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 111 с. : 32 ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ИНОЗИН5МОНОФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА И ОБМЕН

ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Обмен пуриновых нуклеотидов.

1.1.1 Фосфорибозилпирофосфатсинтстаза

1.1.2 Регуляция синтеза I v

1.1.3 Синтез адениловых и гуаниловых нуклеотидов из I .

1.1.4 Утилизация пуриновых оснований и нуклеозидов .

1.1.5 Взаимопревращения пуриновых нуклеотидов

1.2 Инозин5монофосфатдегидрогеназа

1. Место ИМФДГ в биосинтезе пуриновых нуклеотидов.

, . .
1.2.2 Структура и механизм ферментативного катализа ИМФДГ
1.2.3 Ингибиторы ИМФДГ клиническое значение и роль в изучении ферментативного механизма.
1.2.4 Структура субдомена ИМФДГ и его роль в развитии аутосомнодоминантного пигментного ретинита
1.3 Заключение.
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.,
2.1 Микробиологические методы.
2.2 Молекулярногенетические методы.
2.2.1 x рекомбинированис
2.2.2 Конструкция плазмид.
2.3 Измерение внутриклеточных концентраций нуклеотидов
2.4 Измерение активности ферментов в клеточных экстрактах.
2.5 Получение антиИМФДГ антител и иммунноблоттипг
2.6 Измерения кинетики радиоизотопного мечения пуриновых
нуклеотидов
2.7 Анализ кинетики распада пуриновых нуклеотидов.
2.8 Метаболический скрининг
2.9 Дифференциальный гельдисплей и массспектромстрия.
2. Методы статистического анализа
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Конструкция штамма . i МР1 3 .
3.2 Нуклеотидные пулы и активности ферментов пуринового метаболизма штамма МР1 i
3.3 не является аллостерическим регулятором ИМФДГ
3.4 Динамика нуклеотидных пулов при добавлении в среду пуриновых оснований и нуклеозидов.
ч Р. Ь . . . , .
3.5 Кинетика радиоизото1 того мечения пуриновых нуклеотидов
и.
3.6 Эффект мутации i на скорости распада АТР и .
3.7 Метаболический скрининг и токсический эффект аденозина .
3.8 Механизм токсичности аденозина генетический анализ
3.9 Релаксирующий эффект мутации на регуляцию синтеза адениловых нуклеотидов
3. Независимость регуляторной роли еубдомена от каталитической функции ИМФДГ .
. I г . i . . . . . . . , .
3. Сравнение протеомов штаммов 3 и МР1
3. Влияние мутаций, ассоциированных с пигментным ретинитом, на нуклеотидные пульт . i
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ВЫВОДЫ. .
СИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
аденилосукцинатсинтетаза
ГМФР гуанозин5 монофосфатредуктаза
ГМФС гуанозин5 монофосфатсшггетаза
ИМФДГ инозин5монофосфатдегидрогеназа
ИЭФ изоэлектрофокусирование
КОЕ колониообразующая единица
ОЕ оптическая единица
ОП оптическая плотность
ПЦР полимеразная цепная реакция
ТСХ тонкослойная хроматография
ФЭИ фосфоэтиленимин
i 5i, аденозин5дифосфат
i 5, аденозин5монофосфат
i 5i, аденозин5трифосфат
2 С2микофенолат аденин динуклеотид
СТР ii 5i, цитидин5трифосфат
1,4iii, 1,4дитиоОЬтрситол
этилендиамиитетраацетат
i 5i, гуанозин5дифосфат
i 5, гуанозин5монофосфат
i 5i, гуанозин5трифосфат
I ii 5, инозин5монофосфат
мизорибин монофосфат
iii i ii, никотинамид аденин динуклеотид
iii i ii , никотинамид аденин
динуклеотид фосфат неорганический фосфат
i 5i 3i, гуанозин5дифосфат,
дифосфат i пирофосфат
i 5i 3i, гуанозин5трифосфат,
дифосфат
5i 1, 5фосфорибозил1 пирофосфат
додецилсульфат натрия
тиазофурин аденин дипуклсотид
ii 5i, уридин5трифосфат
ХМР xi 5, ксантозин5монофосфат
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Данный факт свидетельствует, что развитие пигментного ретинита, повидимому, не связано с недостатком гуаниловых нуклеотидов в клетках сетчатки, и субдомен ИМФДГ может выполнять какуюто регуляторную роль в обмене пуриновых нуклеотидов, нс связанную с основной функцией фермента. Целью настоящего исследования явилось изучение функциональной роли субдомена ИМФДГ в процессах обмена пуриновых нуклеотидов. ИМФДГ на хромосоме. Исследовать влияние мутации на способность клетки к. I в направлении синтеза гуаниловых и адениловых нуклеотидов. Изучить изменения протеома . ИМФДГ. Научная новизна. Впервые сконструированы бактериальные штаммы, позволяющие прицельно изучать физиологическую роль субдомеиа ИМФДГ i viv. Впервые описан эффект удаления субдомена ИМФДГ i viv на нуклеотидые пулы клетки и распределение потоков I в направлении синтеза адениловых и гуаниловых нуклеотидов. Впервые показана роль субдомена ИМФДГ в процессах регуляции синтеза адениловых нуклеотидов. Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в создании новых представлений о роли субдомена ИМФДГ в обмене пуриновых нуклеотидов клетки. Результаты исследования позволяют рекомендовать сконструированную нами мутантную форму . ИМФДГ. Личный вклад автора заключается всамостоятельном проведении всех представленных экспериментальных исследований,, за исключением, синтеза олигонуклеотидов синтез выполнен в i i i i ii, x , автоматического ДНКсиквенирования выполнено в i ii, x , пептидного синтеза и . Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы используются в научноисследовательской работе, а также в лекционном курсе и на практических занятиях на кафедрах биологической химии и медицинской биологии Смоленской государственной медицинской академии. Апробация работы. Смоленской государственной медицинской академии Смоленск, г. Филадельфия, США, г. Филадельфия, США, г. Штамм . МР1 мутация 0 может быть использован для изучения i viv физиологической роли субдомсна ИМФДГ. Субдомен ИМФДГ является трансрегулятором v синтеза адениловых нуклеотидов из I. Мутации гена ИМФДГ, ассоциированные с развитием пигментного ретинита, вызывают снижение пула адениловых нуклеотидов клетки, но не оказывают влияния на пул гуаниловых нуклеотидов. ГЛАВА I. ОБМЕН ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Обмен пуриновых нуклеотидов один из классических разделов биохимии, волнующий ученые умы более полувека, с тех пор, как были предприняты первые шаги к раскрытию путей биосинтеза этих универсальных клеточных компонентов и осознана их центральная роль в процессах энергетического обмена и . Действительно, вряд ли существует клеточный процесс, будь то биохимический путь или сигнальный каскад, в котором не участвовали бы пуриновые нуклеотиды 2,. Основные реакции и ферменты пуринового метаболизма Е. Рис. Табл. Табл. Буквенные обозначения некоторых генов нуклеотидного метаболизма Е. Необходимо отметить, что несмотря на то, что здесь и далее, мы концентрируем наше внимание на пуриновом метаболизме кишечной палочки, различия в этой области метаболизма между эукариотами и прокариотами невелики пуриновый обмен является одним из самых консервативных биохимических путей природы. Исследования обмена пуринов на модели. Вобоих случаях, предшественником рибозы нуклеозидов и нуклеотидов является . Рис. АТР рибозо5фосфат АМР. I . Несмотря на ключевую роль в синтезе нуклеотидов и аминокислот, в литературе описиы мутанты, полностью или частично лишенные активности синтетазы ,, 0 3. Способность таких штаммов в выживанию зависит от присутствия сопутствующих делеций генов нуклеозид фосфорилаз и увеличения активности гуанозининозинкиназы. РИРР . Точные механизмы регуляции экспрессии РРРРсинтетазы неизвестны, хотя некоторые данные позволяют предположить, что один из пиримидиновых нуклеотидов, предположительно 1ШР, является негативным эффектором экспрессии гена ргз 3. Рис. Распределение потоков в . В процессе v синтеза I фрагменты будущего пуринового кольца поочередно присоединяются к Рис.