Влияние внешних факторов на функционирование легоглобина в клубеньках бобовых растений

• Автор: Петрова, Надежда Эдуардовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил

Оглавление
Введение

Список используемых сокращений

Часть 1. Литературный обзор

Глава 1. Азотфиксирующие клубеньки бобовых растений

1.1. Образование клубеньков.

1.2. Строение клубенька.

1.3. Барьер газовой диффузии.

1.4. Генетический контроль формирования симбиотической системы.

Глава 2. Лсгоглобин и метлсгоглобинрсдуктаза.

2.1. Гемопротеидная природа легоглобина и его локализация в клубеньках.

2.2. Строение молекулы легоглобина.
2.3. Биосинтез легоглобина и его гетерогенность.
2.4. Кислородсвязывающие свойства легоглобина и его состояние в клубеньках.
2.5. Роль легоглобина в симбиотической азотфиксирующсй системе бобового растения и процессы, в которых участвует лсгоглобин.
2.6. Растительные гемоглобины.
2.7. Бактериальные гемоглобины и гемоглобины,
экспрессированные в бактериях.
Глава 3. Воздействие внешних факторов на регуляцию кислородных условий в клубеньках.
3.1. Нитратный стресс.
3.2. Механизмы ингибирования нитрогеназы при нитратном стрессе.
3.3. Действие нитратов и нитритов на кислородпереносящие гемопротеиды.
3.4. Окислительный стресс и активные формы кислорода.
3.5. Источники активных форм кислорода.
3.6. Антиоксидантные защитные системы у растений.
3.7. Антиоксидантная защита в клубеньках бобовых.
Часть 2. Материалы и методы исследований.
1. Растительный материал, использованный в работе.
2. Условия выращивания растений гороха.
3. Выращивание бактерий.
4. Обработка клеток редоксмедиаторами.
5. Получение белков из цитозоля клубеньков.
5.1. Получения цитозоля белков клубеньков люпина и гороха.
5.2. Очистка суммарного легоглобина и его макрокомпонентов
из клубеньков люпина.
6. Получение восстановленного, окисленного
и оксигенированного легоглобина.
6.1. Получение восстановленного и оксигенированного легоглобина.
6.2. Получение окисленного легоглобина.
7. Проведение опытов по взаимодействию легоглобина с нитратом.
в системе i vi.
7. 1. Проведение анаэробных исследований.
7.2. Проведение реакции окисления легоглобина в анаэробных условиях.
8. Определение концентрации легоглобина.
9. Определение активности метлегоглобинредуктазы.
. Определение сырой, сухой массы и эндогенного нитрата.
. Проведение жидкостной колоночной хроматографии.
. Исследования с использованием электронного парамагнитного резонанса.
. Определение прооксидантных свойств легоглобина.
Реактивы, использованные в работе.
Часть 3. Результаты и их обсуждение.
1. Функции симбиотических генов.
1.1. Описание симбиотических мутантов.
Развитие симбиотических структур и морфологическая дифференцировка бактероидов.
1.2. Легоглобин в клубеньках различных генетических линий гороха.
1.3. Метлегоглобинредуктаза в клубеньках исследованных линий гороха.
2. Нитратный стресс.
2.1. Влияние нитрата на физиологические параметры различных
генетических линий гороха.
2.2. Влияние нитратного стресса на легоглобин в клубеньках.
2.3. Взаимодействия нитрита с легоглобином в опытах i vi.
2.4. Модификация метода очистки метлегоглобинредуктазы для проведения опытов с легоглобином i vi.
3. Окислительный стресс.
3.1. Влияние легоглобина на выживаемость клеток . i в условиях окислительного стресса.
3.2. Участие легоглобина в перекисном окислении в опытах i vi.
4. Классическая концепция стресса.
4.1. Влияние стресса на кислородные условия в клубеньке и легоглобин.
5. Четыре типа регуляции поступления кислорода в клубенек.
Выводы
Литература


В то же время клубенек сои имеет сферическую форму и расположен, как правило, на малых корнях. Однако при нарушениях симбиоза, вызванных мутациями ризобий, форма клубеньков может меняться например, у люцерны вместо активных веретеновидных клубеньков формируются неактивные мелкие шаровидные или, напротив, крупные гроздевидные клубеньки циг. Число клубеньков регулируется растением, что может быть связано со значительной энергоемкостью их образования. Авторегуляция клубенькообразования, которая опосредована надземной частью растений, носит системный характер , , . У ряда бобовых были получены мутации, нарушающие такую авторегуляцию. Клубенек это сложно устроенный орган, основными структурами которого являются а инфицированная бактериями ткань, где происходит фиксация молекулярного азота б проводящая ткань, по которой поступают растительные фотосинтаты и выносятся продукты азотфиксации в меристема, за счет которой происходит рост клубенька. Поверхность клубенька покрыта слоем эпидермальных клеток. Под ним находится зона наружной коры клубенька, представленной крупными клетками с большими межклеточными пространствами ii . У сои ее подстилает слой эндодермы, состоящий из клеток с утолщенными стенками. Зона так называемой средней коры образована крупными клетками с утолщенными, но нелигнифицированными стенками и крупными межклетниками. Область, подстилающая среднюю кору, включает клетки пограничной зоны, тесно сомкнутые, без заметных межклетников, а также клетки зоны растяжения, небольших размеров и с большими межклеточными пространствами , , . Эти два типа клеток часто объединяют под общим названием внутренней коры ii, . Непосредственно подобластью внутренней коры расположена центральная зона клубенька с гипертрофированными клетками растенияхозяина, в цитоплазме которых локализованы бактероиды. У большинства бобовых инфицированные клетки в этой зоне чередуются с более мелкими неипфицированными клетками. Такая типичная структура описана нами на примере сои i x. У некоторых бобовых в структуре клубеньков могут быть весьма существенные отличия. Особо следует рассматривать функционирование барьера диффузии в стеблевых клубеньках i , так как в них необходимо учитывать и наличие фотосинтетической хлорофиллсодержашей зоны коры. Этот вопрос был поднят в работе . Среди клубеньков бобовых выделяют детерминированные меристема существует лишь несколько дней, а после ее исчезновения рост клубенька прекращается и недетерминированные меристема функционирует несколько месяцев, обеспечивая постоянное обновление азотфиксирующей ткани клубенька. Эти типы клубеньков различаются по многим морфофизиологическим характеристикам. Клубеньки различаются и по другому признаку. У люцерны, вики, чины есть границы между старыми и новыми зонами, в клубеньках люпина они отсутствуют. Недетерминированные клубеньки горох, люцерна представляют собой очень удобную модель для анализа поздних стадий развития симбиотического аппарата. Схема строения такого клубенька представлена на рисунке 1. На рисунке 2 схематически изображена инфицированная клетка. Видно, что митохондрии и пластиды оттесняются к клеточным стенкам, а симбиосомы с бактероидами располагаются в центре клетки. Существуют данные, что перибактероидное пространство за вычетом объема, занятого бактероидами, составляет около объема растительной клетки , , , то есть оно является важной характерной структурой клубенька. Легоглобин содержится в цитозоле растительной клетки, окружающем перибактероидную мембрану. Одним из основных действующих лиц симбиоза является нитрогеназа мультимерный фермент с мол. Да цит. Кретович, , синтезируемый в бактероидах и катализирующий восстановление молекулярного азота. Рис. Ь проводящая ткань клубенька с эндодерма корня с эндодерма клубенька е слой эндодермы вокруг проводящего пучка клубенька Г дистальная часть клубенька, содержащая неннфицнронанную меристему звездочкой обозначена зона инвазии й центральная часть клубенька, содержащая ненифицированмую меристему. Рис. Схема инфицированной клетки клуОенька люпина.