Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В

• Автор: Пичковская, Виктория Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 68 с. : 18 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирус гепатита В.

1.1.1. Морфология вирусных частиц..

1.1.2. Организация генома и продукты вирусных генов

1.1.3. Жизненный цикл вируса

1.1.4. Мутационные изменения генома вируса .

1.1.4.1. Ргесогемутация в Сгене.

1.1.4.2. УМОймутация в Ргене

1.1.5. Изменение концентрации вируса в крови. в

1.2. ПЦРДИАГНОСТКА ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В.
1.2.1. Количественная ПЦРдиагно етика
1.2.2. ПЦРдиагностикаргесоге и УМВИмутаций.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Создание банка сывороток
2.2. Выбор праймеров для ПЦР.
2.3. Полимеразная цепная реакция.
2.4. Аллельспецифическая полимеразная цепная реакция
2.5. Гельэлектрофорез амплифицированной ДНК.
2.6. Клонирование внутреннего стандарта
2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК.
2.8. Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом
конкурентной ПЦР
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Получение внутреннего стандарга для конкурентной ПЦР
3.2. Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.
3.3. Детекция УМООркесояемутаций в ДНК вируса гепатита В
4. ОБСУЖДЕНИЕ
выводы. ..1т1инпт.тмм.м.мктн.н.1.тп1н.нианмнмин СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ г
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Обратная транскриптаза, осуществляющая этот процесс, лишена 3 корректирующей функции, что определяет вариабельность вирусного генома. В сочетании с высокой репликативной активностью вируса гепатита В это приводит к повышению вероятности ошибки считывания РНКматрицы и появлению мутантных штаммов. В свою очередь, мутации вирусного генома могут изменять профиль серологических маркеров, приводить к снижению эффективности стандартных схем противовирусной терапии и т. Отсюда возникла необходимость в комплексной диагностике вирусного гепатита В, включающей количественную оценку вируса в крови больного и анализ мутаций вирусного генома. С этой целью сегодня применяются различные методы генодиагностики, в частности метод полимеразной цепной реакции ПЦР. Наиболее распространенным методом количественной оценки вируса гепатита В является конкурентная ПЦР, основанная на коамплификации ДНК патогена и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта. Создание подобного внутреннего стандарта составляет определенную сложность, что ограничивает применение количественных тестсистем, основанных на методе конкурентной ПЦР, в клинической диагностике. и ргесогемутаций, ассоциирующихся со снижениемотсутствием эффективности противовирусной терапии нуклеозидными аналогами или препаратами интерферона. Кроме того, мутация определяет отсутствие основного маркера активной репликации вируса НВеантигена. и мутации вызваны однонуклсотидными заменами в ДНК вируса гепатита В. Поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции i i i. В большинстве случаев с этой целью используют методы секвенирования и определения длин рестрикционных фрагментов. Но данные методики обладают рядом недостатков они технически сложны в исполнении и с их помощью довольно трудно оценить долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Тем не менее, такая информация необходима для выработки эффективной тактики лечения больных вирусным гепатитом В. Цель работы. Создать оптимальные диагностические тестсистемы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В. Задачи исследования. Разработать методически простую технологию конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР на примере вируса гепатита В. Разработать диагностическую тестсистему для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР, в которой будет использоваться полученный внутренний стандарт. Найти оптимальный метод для выявления дикого и мутантных штаммов вируса гепатита В, позволяющий оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Апробировать разработанные тестсистемы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В на сыворотках больных вирусным гепатитом В. Научная новизна. Впервые предлагается универсальный и методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР. ДНК от до геноммл. Причем проведение аллельспецифической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Практическое значение работы. Предложенная технология конструирования внутреннего стандарта упрощает разработку тестсистем для определения количества ДНК вируса гепатита В, основанных на методе конкурентной ПЦР. Применение конкурентной и аллельспецифической ПЦР для оценки количества и детекции мутаций в геноме вируса позволяет контролировать эффективность терапии больных вирусным гепатитом В и корректировать протокол лечения в случае выявления мутантных штаммов. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на кошрессе Человек и лекарство Москва, , I Всероссийском съезде гематологов Москва, , научнопрактическом симпозиуме Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении, проводимом в рамках международной научнопрактической конференции Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины Москва, .