Связывание рибосомных белков S5 и S16 человека с участком 1203-1236/1521-1698 3`-концевого домена 18S pРНК

• Автор: Яньшина, Дарья Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. РНКбслковые взаимодействия в малых субчастицах рибосом про и эукариот Обзор литературы

1.1. Сборка малой субчастицы рибосомы прокариот i vi

1.2. Подходы к изучению РНКбелковых взаимодействий в малых субчастицах рибосом

1.2.1. Футпринтинг

1.2.2. Метод X

1.2.3. Мутагенез

1.2.4. Метод сшивок

1.2.5. Протеомный анализ

1.3. Взаимодействие сердцевинных белков субчастнцы рибосомы
с рРНК
1.3.1. Взаимодействие рибосомного белка с рРНК
1.3.1.1. Участок связывания на рРНК по данным, полученным биохимическими методами
1.3.1.2. Участок связывания на рРНК по данным рентгеноструктурного анализа
1.3.2. Взаимодействие рибосомного белка 8 с рРНК
1.3.2.1. Участок связывания 8 на рРНК по данным, полученным биохимическими методами
1.3.2.2. Участок связывания на рРНК по данным рентгеноструктурного анализа
1.3.3. Взаимодействие рибосомного белка 7 с рРНК
1.3.3.1. Участок связывания 7 на рРНК по данным, полученным биохимическими методами
1.3.3.2. Участок связывания 7 на рРНК по данным рентгеиоструктурного анализа
1.3.4. Взаимодействие рибосомного белка 4 с рРНК
1.3.4.1. Участок связывания 4 на рРНК по данным, полученным
биохимическими методами
1.3.4.2. Участок связывания гр нарРНК по данным рентгеноструктурного анализа
1.3.5. Взаимодействие рибосомного белка Б с Б рРНК
1.3.5.1. Участок связывания грБ на рРНК по данным, полученным биохимическими методами
1.3.5.2. Участок связывания грБП на рРНК по данным рентгеноструктурного анализа
1.3.6. Взаимодействие рибосомного белка 0 с 8 рРНК
1.3.6.1. Участок связывания гр0 на рРНК по данным, полученным биохимическими методами
1.3.6.2. Участок связывания гр0 на рРНК по данным рентгеноструктурного анализа
1.4. Сборка малой субчасгицы рибосомы эукариот
1.5. Подходы к изучению структуры 8 субчасгицы
1.6. Заключение
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.2. Выделение .8 субчастиц рибосом человека
2.3. Выделение суммарного Б рибосомного белка
2.4. Диссоциация белков из Э субчастнц рибосом человека в градиенте концентрации 1ЛС1
2.5. Анализ рибосомных белков Ш гельэлектрофорезом
2.5.1. Окрашивание белков в геле после их разделения Ш гельэлектрофорезом
2.6. Анализ рибосомных белков 2Э гельэлектрофорезом
2.6.1. Окрашивание белков в геле после их разделения 2Э гельэлектрофорезом
2.7. Анализ рибосомных белков, выделенных из геля после
электрофореза, с помощью Ш гельэлскгрофореза
2.8. Получение ДНКматрнцы для синтеза фрагмента
Б рРНК
2.9. Получение немеченого РНКтранскрипта
2 Получение Рмсченого РНКтранскрипта
. Получение статистически меченого фрагмента ЗГЗт
. Введение радиоактивной метки на 5конец фрагмента ЗОт
. Введение радиоактивной метки на 3конец фрагмента ЗОт
2 Связывание фрагмента ЗОт с рекомбинантными рибосомиымн белками и определение кажущихся констант ассоциации
2 Секвснированис фрагмента ЗОт
2 Фермен тативный футпринтинг
2 Химический фу гпршггинг
ГЛАВА 3. Связывание рибосомных белков и Б человека с участком Зконцевого домена 5 рРНК
3.1. Результаты и обсуждения
3.1 Л. Диссоциация белков из А ОБ субчастиц рибосом человека в градиенте концентрации хлористого лития
3.1.2. Связывание гр и грЯ человека с фрагментом 8 рРНК
3.1.2.1. Конструирование ДНКматрицы и синтез фрагмента ЗОт
3.1.2.2. Комплексообразование белков и с фрагментом ЗОт
3.1.3. Химический иили ферментативный футпринтинг фрагмента ЗОт
в комплексе с грБ или грБ5
3.1.3.1. Ферментативный и химический футпринтинг фрагмента ЗОт
в комплексе с гр
3.1.3.2. Ферментативный футпринтинг фрагмента ЗОт в комплексе
с грБ5
3.1.3.3. Ферментативный и химический футпринтинг фрагмента ЗОт
в комплексе с гр и ф
3.2. Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Один из наиболее доступных на сегодняшний день подходов к изучению РНКбслковых взаимодействий в рибосомных субчастицах эукариот основан на использовании рекомбинантных рибосомных белков и фрагментов РНК, отвечающих за эти взаимодействия. Такие фрагменты могут быть получены в системе транскрипции i vi. Аналогичный подход был успешно использован ранее для изучения взаимодействия различных прокариотических рибосомных белков с РНКтранскриптами, соответствующими фрагментам рРНК, содержащим сайты связывания этих белков см. Цслыо настоящей работы являлось изучение диссоциации субчастиц рибосом человека в радиенте концентрации моновалентных катионов для выявления так называемых сердцевинных рибосомных белков, которые наиболее прочно удерживаются на рРНК, и исследование связывания некоторых из них, в частности белков 5 и , с рРНК с помощью вышеуказанного подхода. Рибосомный белок гр от англ. РНК известны. РНК человека нуклеотиды фрагмент 3, гомологичный району рРНК, содержащему участки связывания 7 и 9. М в присутствии 4 мМ и 0. РНК в субчастице. На момент начала настоящей работы данные о молекулярных контактах в субчастице эукариотической рибосомы практически отсутствовали. ГЛАВА 1. Одной из важнейших задач молекулярной биологии является изучение молекулярных механизмов процесса трансляции на рибосомах, в результате которого синтезируются полипептидные цепи белков по матрице информационной РЫК согласно генетическому коду. Рибосома представляет собой бионаноструктуру, в состав которой входят рРНК 3 молекулы у прокариот и 4 у эукариот и нековалентно связанные с ними более чем полсотни различных белков. Классифицируют эти белки согласно их принадлежности к субчастице, в которой они находятся белки, принадлежащие к малой рибосомной субчастице, обозначают литерой , а к большой , и по их подвижности в геле при разделении двумерным гельэлектрофорезом в системе, где разделение в первом направлении происходит при 8. Малая субчастица рибосомы . РНК длиной нуклеотид и имеет коэффициент седиментации см, например, 6. В состав субчастицы эукариотической рибосомы входят примерно белка и рРНК длиной ог нуклеотидов у дрожжей до нуклеотидов у человека 8. Все рибосомные белки имеют хорошо организованную вторичную и третичную структуры, поверхности почти всех белков очень основны и имеют лишь незначительное количество участков с отрицательным потенциалом 6. Большая часть эукариотических рибосомиых белков малой субчастицы имеет гомологи среди прокариотических белков табл. Но у дрожжей и млекопитающих степень гомологии рибосомных белков в среднем достигает . Наиболее высокая степень гомологии рибосомных белков характерна для млекопитающих она составляет 0 в случае рибосомных белков крысы и человека 9. Вторичная структура рРНК содержит регулярных двойных спиралей, соединенных петлевыми участками рис. Спирали Н и Н рРНК вовлечены в формирование 3малого домена нуклеотиды , И. Эу бактерии . В последовательности рРНК выделяют как эволюционно консервативные, так и вариабельные участки . Консервативный кор охватывает большую часть нуклеотидов рРНК, прерываясь в определенных местах вариабельными участками, которые обычно называют сегментами экспансии от англ. Наличие в рРНК, а также присутствие ряда негомологичных белков в составе малой субчастицы эукариотической рибосомы привело к усложнению структуры по сравнению с субчастицей прокариотической рибосомы. В частости, с помощью криоэлектроиной микроскопии субчастицы ivii обнаружена дополнительная плотность в нижней части тела, где субчастица четко подразделяется на левую ногу и правую ногу i , а также под платформой, в области клюва и на голове с внешней стороны рис. Н . На
Н АА. А I де . Ъс. Vi. II . V . Ч нзз. И.ШГГ
i. Л
5 . Ч
ас 1 ь. ЧсааА
Фи
Н
фГ. Vе и i сна сй. Гл, Нба . Рис. Полная нуклеотидная последовательность и рассчитанная вторичная структура рРНК i 1. Выделены 4 основных структурных домена. Черным цветом указаны номера нуклеотидов, как принято для Т. Нумерация нуклеотидов и спиразей дана согласно , . Символом Дп указаны делении относительно рРНК . Т. i места делеций указаны красными стрелками. Зелной рамкой обведены нуклеотиды, присутствующие только в нуклеотидной последовательности рРНК Т.