Моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в оценке проницаемости гемаоэнцефалического барьера при экспериментальной глиоме С6

• Автор: Юсубалиева, Гаухар Маратовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : 27 ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ. ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

1.1. Общие аспекты применения моноклональных антител в онкологии

1.1.1. Иммунохимический анализ в онкологии

1.1.2. Диагностические и лекарственные препараты на основе МАТ в онкологии

1.2. МАТ в диагностике и терапии опухолей головного мозга.

1.2.1. Молекулярные механизмы деструкции ГЭБ в процессе опухолевой инвазии глиобластом.

1.2.2. Потенциальные мишени для иммунодиагностики и иммунотерапии глиом

1.2.3. Роль СТАР в реактивном глиозе в ответ на опухолевую инвазию

1.2.5. Перспективы диагностики и терапии низкодифференцированных глиом с помощью меченых радионуклидом моноклональных антител
1.3. Резюме.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика исследуемого материала
2.2. Общая характеристика экспериментальной работы
2.3. Моделирование интракраниальной глиобластомы
2.3.1. Культивирование глиомных клеток С6.
2.3.2. Стереотаксическое введение глиомных клеток С6 в каудопутамен мозга крысы
2.3.3.Оценка развития имплантированной глиомы С
2.4. Ги его логические методы.
2.4.1. Окрашивание срезов мозга крезиловым фиолетовым и толлуидиновым синим для оценки инвазии имплантированных глиомных клеток С
2.4.2. Окрашивание срезов мозга ванадиевым кислым фуксином с последующим докрашиванием толуидином Л
2.5. Иммунохимические методы
2.5.1. Аффинная хроматография МАТ на протеинАагарозе
2.5.2. Иммуногистохимичсский анализ антигенов, ассоциированных со структурами ГЭБ.
2.5.3. Иммунофлюоресцентное исследование методом световой и лазерной конфокальной микроскопии антигенов структур, формирующих ГЭБ, па срезах головного мозга крыс с глиомой С6.
2.5.4. Иммуноферментный анализ СРАР в сыворотке крови крыс
2.6. Радиохимические методы.
2.6.1. Коньютрование МАТ с радиоактивным I
2.6.2. Тонкослойная хроматография препарата 5ТМАТ
к 2.6.3. Дискэлектрофорез препарата 1МАТ.
2.6.4. Анализ радиоактивности МАТ в органах крысы с глиомой С
2.6.5 Контактная радиоавтография срезов головного мозга крыс с глиомой С
2.6.5 Кислотная преципитация органов крыс с глиомой С6 после внутривенного введения меченных МАТ.
2.7. Схема эксперимента по оценке селективного накопления в органах МАТ.
2.7.Статистическая обработка полученных результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛИОМЫ С6 КРЫСЫ
3.1. Результаты оценки инвазии глиомы С6 по общему состоянию крыс и по неврологическому статусу.
3.2. Гистологический анализ инвазии глиомных клеток С6.
3.3. Иммуногистохимический анализ АМЪ1, ЕВА и СРАР на срезах головного мозга крыс с глиомой С
3.4. Оценка проницаемости ГЭБ с помощью высокомолекулярных агентов при развитии глиомы С
ГЛАВА 4. ИФА вРАР В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС С ГЛИОМОЙ С6 С ПОСЛЕДУЮЩИМ ИЗУЧЕНИМ ВЗАИМОСВЯЗИ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЛИОМЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ СРАР В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС В ДИНАМИКЕ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА
4.1. Характеристика нммунофсрментной тестсистемы и нормальные показатели СРАР в сыворотке крови крыс.
4.2. Динамика концентрации ОБ АР при экспериментальной глиоме С6.
4.3. Морфометрический анализ глиомы С6 на серийных гистологических срезах мозга в разные сроки ее инвазии
4.4. Морфометрическин анализ асгроглиального вала на серийных срезах мозга методом флюоресценции
4.5. Динамика развития глиомы по данным МРТисследования.
4.6. Корреляционный анализ показателей морфометрии и концентрации СРАР в сыворотке крови
ГЛАВА 5. НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ К ОБ АР и АМУВ1 В ОБЛАСТЬ ГЛИОМЫ С6 ПРИ ВВЕДЕНИИ В СИСТЕМНЫЙ КРОВОТОК КРЫСЫ
5.1. Характеристика МАТ.
5.2. Распределение меченых антител к СРАР и АМУВ1 в органах после внутривенного введения крысам с экспериментальной глиомой С6.
5.2.1. Кинетика меченных МАТ в крови
5.2.2. Распределение меченных МАТ во внутренних органах крыс с глиомой С6
5.2.3. Накопление меченных 1 МАТ к СРАР и АМУВ1 и 1Ст в полушариях мозга крыс с глиомой С
5.2.4. Конкурентное ингибирование накопления меченных антител к СРАР в пораженном полушарии мозга крыс
5.3. Контактная авторадиография препаратов головного мозга крыс с глиомой С6 после
введения меченных I антител
5.4. Биодеградация йодированных МАТ в крови и органах после введения в системный кровоток крысам с глиомой С6.
ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
ЛИТЕРАТУРА


Провести корреляционный анализ сывороточной концентрации , объма глиомы по данным МРТ и морфомегрических показателей глиомы и астроцитарного вала. Оценить накопление меченых антител к в мозге и в других органах крыс при экспериментальной глиоме С6 с помощью анализа радиоактивности в образцах органов и контактной радиоавтографии срезов. Впервые проведено динамическое исследование развития астроглиального вала вокруг имплантированной глиомы Сб. Показано, что положительные реактивные астроциты сопровождают инвазию глиомы на всех сроках ее развития. Впервые продемонстрирован феномен селективного накопления меченых 1 анти антител в полушарии головного мозга с глиомой, более чем в раз превышающий накопление этих же антител в нормальной ткани. Впервые при экспериментальной глиоме С6 показана взаимосвязь уровня и объема астроцитарного вала. Впервые разработан и применен для визуализации клеточных компонентов ГЭБ метод двойного иммуноиероксидазного анализа с помощью антител различной специфичности. Впервые с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии исследована ультраструктурная локализация V эндотелиоцитах микрососудов, формирующих ГЭБ. Показано, что этот антиген локализуется на аблюминальной иили базальной мембране эндотелиоцитов. Количественный мониторинг концентрации в сыворотке крови может быть использован в качестве диагностического критерия состояния внутримозговой глиомы. Иммуногистохимический анализ эндотелиальных антигенов ЕВА и V может применяться в экспериментальных исследованиях i vi и i viv для характеристики сосудистой системы глиом. Селективность меченных Ь1 анти антител антител, обусловленная взаимодействием с антигеноммишенью в области астроглиального вала вокруг глиомы, позволяет рекомендовать их в качестве векторов в системах направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в опухоль. Апробация диссертационной работы была проведена на заседании Проблемного Совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ ГНЦ ССП Росздрава . Основные положения диссертации были представлены в периодической печати, на межлабораторных конференциях ФГУ ГНЦ ССП Росздрава гг. Киев, Украина, г. СанктПетербург, г. ЕШЮМАЯ Санкт Петербург, , международном конкурсе молодых ученых в области нанотехнологий Iю Москва, . Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 3 машинописных страницах и содержит рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает отечественных и 4 иностранных источника. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1. Гибридомная технология позволяет получать неограниченное количество МАТ к разнообразным антигенам , . Их эффекгивно используют в иммунодиагностикумах на серологические маркеры опухолей, а также в лабораторной диагностике многих заболеваний 1, , , , . Препараты МАТ очень точные и высокочувствительные компоненты диагностических тестсистем, поскольку являются продуктом одного клона гибридных клеток. Особенность гибридных клеток заключается в постоянстве физикохимических свойств и и продукции МАТ к строго определенной антигенной детерминанте. Они применяются для определения иммунного статуса пациентов, контроля эффективности лечения онкологических заболеваний . А, С, простой герпес, клещевой энцефалит, цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ, для определения биологически активных веществ белков крови, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и др. Технология получения МАТ явилась мощным инструментом для научных исследований в области биологии, онкологии, иммунологии и медицины, что открыло широкие перспективы для создания новых диагностических и лечебных средств ,, , . Одним из первых зарекомендовавших себя применений моноклональных антител в онкологической практике является ИГХ с целью феиотипирования опухолей. Иммунофенотипирование опухолей связано с выявлением ее гистогенеза 4, . Наиболее распространено иммунофенотипирование лимфом с помощью идентификации экспрессируемых антигенов по классификации СО.