Экстрахромосомная рибосомная ДНК у дрожжей

• Автор: Гришин, Анатолий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 108 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

1. Дрожжи имеют типичную для эукариот организацию рибосомной ДНК обзор литературы .

1.1. Молекулярная организация рДНК .

1.1.1. Избыточность генов рРНК .

1.1.2. рДНК тяжелая фракция дрожжевой ДНК .

1.1.3. Гены всех типов рРНК физически сцеплены

1.1.4. Повторяющиеся единицы рДНК. Порядок расположения единиц.

1.1.5. Репликация рДНК

1.1.6. Изменение количества рДНК

1.1.7. Магнификация . I

1.1.8. Амплификация .
1.2. Генетические и цитологические аспекты рДНК .
1.2.1. Ядрышко.
1.2.2. Наследование рДНК.
1.2.3. Ректификация .
1.2.4. Рекомбинация внутри блока рДНК .
2. Материалы и методы .
2.1. Штаммы микроорганизмов и условия культивирования
2.2. Выделение гшазмидной ДНК из дрожжей.
2.3. Выделение хромосомной и митохондриальной ДНК дрожжей .
2.4. Выделение хромосомной рДНК дрожжей
2.5. Нейтральные градиенты СзС1 .
2.6. Выделение общей клеточной РНК дрожжей .
2.7. Введение радиоактивной метки в нуклеиновые кислоты
Стр.
i vi
2.. Синтез комплементарной радиоактивной РНК
2.9. Гибридизация ДНКРНК.
2 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции. Лиги
рование фрагментов ДНК .
2. II. Трансформация в. i
2 Выделение плазмид из в.i
2 Электрофорез в агарозном геле
2 Электронная микроскопия ДНК.зэ
2 Трансформация дрожжей.
3. Результаты4
3.1. Выделение кольцевой ковалентнозамкнутой ДНК из штамма дрожжей 61ГП8.
3.2. Плавучая плотность ковалентнозамкнутой ДНК из штамма 61ГП8
3.3. Результаты электрофореза ковалентнозамкнутой ДНК из штамма 61ГП8 .
3.4. Физическое картирование 3 мкм ДНК. Клонирование фрагментов 3 мкм ДНК
3.5. Молекулярная гибридизация 3 мкм ДНК с различными последовательностями дрожжевого генома
3.6. Электронная микроскопия препарата 3 мкм ДНК
3.7. Выделение 3 мкм ДНК из штамма 1ГД8
3.8. Сравнение рестрикционных профилей хромосомной и
экстрахромосомной рибосомной ДНК.
3.9. Конструирование векторов на основе фрагментов
3 мкм ДНК и исследование их свойств
Обсуждение
Выводы . 8э
Список литературы


Обнаружен штамгл с повышенным содерхсалием зкстрахромосомной рДНК, что в сочетании с оптимизацией метода выделения дало возможность препаративно выделить экстрахромосснную рДНК. Построена рестрикционная карта зкстрахромосомной ДИК. Проведено сравнение хромосомной и экстрахромосомной рДРПС по соотношению двух вариантов повторяющихся единиц, показавшее относительную автономность зкстрахромосомной рДНК. Доказана способность кольцевых молекул рДНК к автономной репликации. Определено соотношение олигомерных форм новой плазмиды. Обнаружено несколько классов кольцевых молекул дрожжевой ДНК неизвестной природы. Практическое значение. Изучение свойств зкстрахромосомной рДКК дрожжей позволило сконструировать новый класс дрожжевых векторов для создания штаммовпродуцентов биологически активных веществ методами генной инженерии. Высокая степень гомологии рДНК разных видов предполагает возможность использования этих векторов для трансформации иных, чем сахаромицеты, промышленноважных штаммов дрожжей. Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1У рабочем совещании по программе Плазмида Тарту, , на У рабочем совещании по программе Плазмида Краснодар, , на международная симпозиуме по молекулярной биологии дрожжей Колд Спринг Харбор, СМ, и опубликованы в соответствующих материалах этих совещаний. Объем диссертации. Работа цредставлена на 6 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и рисунков. Список литературы включает 5 наименовании публикаций на русском 7 и иностранных 8 языках. Всем эукариотам свойственен единый план строения рДНКх, на фоне которого отдельные представители этого царства могут иметь те или другие особенности. Так, гены рРНК у эукариот всегда избыточны, за редкими исключениями сблокированы генетически и цитологически, синтез больших рРНК идет через стадию общего предшественника и т. Высшие эукариоты могут иметь специфические черты организации рДНК, связанные с особенностями их жизненных циклов, как например, амплификацию рДНК. Низшие эукариоты дрожжи, как будет показано ниже, имея типичную эукариотическую организацию рДНК, проявляют в примитивной форме некоторые специфические черты организации, свойственные высшим эукариотам. I.I. I.I. I. Избыточность генов рРНК. Четыре класса рРНК , i, 5, и 5 в эквимолярном соотношении входящие в состав рибосом, вместе составляют преобладающую часть клеточной РНК. Каждое клеточное деление должно сопровождаться удвоением количества рРНК. Важнейшим приспособлением, обеспечивающим интенсивный синтез рРНК, является избыточность генов рРНК. Число генов рРНК в гаплоидном геноме дрожжейсахаромицетов было определено методом насыщающей гибридизации. Сокращения рРНК рибосомная РНК рДНК рибосомная ДНК, гены, кодирующие рРНК тРНК транспортная РНК. При избытке рРНК все комплементарные ей участки ДНК вступают в гибридизацию. Зная содержание ДНК в гаплоидном геноме, размер структурного гена рРНК он такой же, как и размер самой РНК и процент ДНК, вошедшей в гибриды, можно рассчитать число генов рРНК. Оно оказалось равным 00 для различных штаммов дрожжей ,,4 О штаммовых различиях количества рДНК на гаплоидный геном см. Избыточность генов рРНК свойственна всем эукариотам. Как правило, избыточность рДНК коррелирует положительно с размером гаплоидного генома. У дрозофилы доза генов рРНК равна 0 6, у ксенопуса 0 Ц2. ДНК тяжелая фракция дрожжевой ДНК. ДНК дрожжейсахаромицетов состоит из трех фракций, различающихся по плавучей плотности в градиенте СвС1 . Кроме основного компонента, . I3 , с плотностью 1,3 гсм3, и , плотностью 1,5 гсм3 ,,2. ДНК имеет митохондриальное происхождение 0. ДНК количественно содержит гены всех четырех рРНК, как это было показано по гибридизации и, кроме того, возможно некоторые из генов тРНК. ДНК составляет от 7 до 6 всей клеточной ДНК. Содержание ДНК в том или ином штамме дрожжей пропорционально дозе генов рРНК в этом же штамме, определенной по насыщающей гибридизации с рРНК таким образом, дозу генов рРНК можно определять не только по гибридизации,но и по количеству саттелита в препарате ДНК .