Распространение путей свободного окисления дыхательных субстратов и регуляция их экспрессии в митохондриях высших растений

• Автор: Фоменко, Олег Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Механизмы снижения внутриклеточной концентрации кислорода

1.2. Феномен свободного окисления

1.3. Разобщнное дыхание как способ свободного окисления

1.3.1. Термогенин бурого жира млекопитающих

1.3.2. Растительный разобщающий митохондриальный белок

1.3.3. Разобщнное дыхание и антипортер

1.4. Молекулярные механизмы несопряжнного дыхания

1.4.1. x оксидоредуктазы тина II

1.4.1.1. Распространнность ротеноннечувствительных 0РНдегидрогеназ
1.4.1.2. Классификация ротеноннечувствительных ШЭРНдегидрогеназ
1.4.1.3. Первичная структура ротеноннечувствительных ЫАОРНдсгидрогеназ
1.4.1.4. Взаимодействие хинонов с дегидрогеназами типа II
1.4.1.5. Экспрессионная регуляция ротенон нечувствительных
1.4.1.6. Физиологическая роль дегидрогеназ
типа II
1.4.1.7. Терапевтические аспекты ротенон нечувствительных ЫАОРНдегидрогеназ
1.4.2. Альтернативная оксидаза
1.4.2.1. Строение альтернативной оксидазы
1.4.2.2. Регуляция активности альтернативной оксидазы
1.4.2.3. Функции альтернативного пути
1.4.2.4. Роль Альтернативной оксидазы в патогенезе
2. Экспериментальная часть
2.1. Цели и задачи
2.2. Объекты и методы исследования
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Постановка эксперимента по созданию светового режима
2.2.3. Выделение растительных митохондрий
2.2.4. Определение количества белка
2.2.5. Определение активности ферментов
2.2.6. Очистка ПАЯКдегидрогеназы
2.2.7. Выделение суммарной клеточной популяции РНК
2.2.8. Обратная транскрипция
2.2.9. Проведение полимеразной цепной реакции
2.2 Количественный ПЦРанализ
2.2 Определение уровня экспрессии генов
2.2 Секвенирование ПЦРпродукта
2.2 Компьютерные методы анализа
2.2. Определение мембранного потенциала растительных
митохондрий
2.2 Статистическая обработка данных
2.3. Результаты и их обсуждение
2.3.1. Распространнность внешних ротенон нечувствительных ЭНдегидрогеназ
2.3.2. Особенности окисления ЫАОзависимых субстратов в эндосперме клещевины
2.3.3. Идентификация и клонирование гена внешней ротенон
нечувствительных ЫАОНдегидрогеназы томата
2.3.4. Идентификация и клонирование гена внутренней ротеноннечувствительной ЫАОНдегидрогеназы томата
2.3.5. Тканевая локализация внешней ротеноннечувствительных ЫАОНдегидрогеназы томата
2.3.6. Органоспецифическая экспрессия гена внешней ротеноннечувствительных ЫАОНдегидрогеназы томата
2.3.7. Влияние света на активность внешней ротеноннечувствительных КАОНдегидрогеназы
2.3.8. Световая регуляция экспрессии генов путей свободного окисления томата
2.3.9. Влияние красного света на активность внешней ротеноннечувствительных А ОНдегидрогеназы
2.3 Регуляция экспрессии внешней ротеноннечувствительных КАОНдегидрогеназы светом различных длин волн
2.3 Разобщающий эффект лауриновой кислоты Заключение
Список литературы


В тканях томата с использованием ОТПЦР анализа впервые идентифицированы гены внешней и внутренней ротеноннечувствительных НАОРНдегидрогеназ. Разработка эффективной ПЦРРВ тестсистемы позволила установить механизм регуляции экспрессии гена томата в условиях различного светового режима. Показано, что в течение светового дня количество соответствующей информационной РНК возрастает, снижаясь с наступлением темноты. Активация транскрипции гена объясняется, на наш взгляд, необходимостью эффективного и быстрого окисления восстановительных эквивалентов для предотвращения ситуации переполнения ЭТЦ на свету. На основе анализа действия света различного спектрального состава изучен механизм регуляции внешней ротеноннечувствительной дегидрогеназы активной формой фитохрома А. ИАОН митохондриями листьев растений под действием красного света. Изучены механизмы разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях клубней картофеля. Показано, что активность ротеноннечувствительных ЫАПРНдегидрогеназ в них низка, а основным механизмом свободного окисления дыхательных субстратов выступает разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования, вызываемое свободными жирными кислотами, причм уровень разобщнности митохондрий возрастает при воздействии на растения пониженных температур. С использованием ингибиторного анализа показано, что основным механизмом разобщения является функционирование АТРАОРантипортера. Кроме того, установлено, что пониженная активность внешней ротеноннечувствительной КАЛРНдегидрогеназы в тканях картофеля компенсируется повышенным содержанием в них белков, разобщающих дыхание и окислительное фосфорилирование. Работа расширяет и углубляет знания о механизмах регуляции путей свободного окисления дыхательных субстратов в митохондриях высших растений в условиях изменения светового режима и воздействия пониженных температур. Установленное участие фитохромной системы, в частности фитохрома А, в регуляции экспрессии и активности внешней ротеноннечувствительной ЫАПРНдегидрогеназы является одним из механизмов, координирующих взаимосвязь фотосинтеза и дыхания растений. Полученные данные по экспрессии гена п1Ы томата указывают на функциональные изменения в работе генетического аппарата клетки в течение суток в зависимости от источника энергии и степени восстановленности электронтранспортной цепи митохондрий. Практическая значимость. Разработанная тестсистема для анализа ПЦРРВ паттернов экспрессии генов, кодирующих ферментативные системы свободного окисления митохондрий высших растений, может быть легко адаптирована для изучения функционального состояния электронтранспортной цепи многих видов культурных растений. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма позволяет приблизиться к пониманию функционирования растительного организма как целостной системы. Полученные данные по экспрессии генов путей свободного окисления при изменении светового режима создают условия для решения проблем, связанных с повышением продуктивности и урожайности культурных растений, а также устойчивости растений к воздействию неблагоприятных факторов среды и патогенов. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биологопочвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по Физиологии растений, Биохимии, в спецкурсах Дыхание растений, Фотосинтез, Метаболизм органических кислот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Воронежского государственного университета Воронеж, ,. Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в публикациях 6 статьях и 6 тезисах. Структура и объм работы. Диссертация изложена на 9 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы 0 источников. Иллюстрационный материал включает рисунка и 4 таблицы.