Выявление и частичная характеристика белков клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающих свойствами амилоидов

• Автор: Горковский, Антон Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 218 с. : ил.

Оглавление
Оглавление.

Список сокращений

Введение.

Обзор литературы Амилоидные белки.

1. Амилоиды структура и механизм формирования.

2. Характерные особенности структуры амилоидов и теоретические основы подходов, применяемых при их изучении.

2.1. Выявления потенциально амилоидогенных последовательностей в составе

поли пептидной цепи белка i ii

2.2. Экспериментальные подходы, применяемые при изучении структуры амилоидных фибрилл

3. Распространенность амилоидов в природе

4. Внеклеточные и поверхностные амилоиды микроорганизмов.
4.1. Амилоиды, формирующие фимбрии пили бактерий.
4.2. Амилоиды, обеспечивающие гидрофобноегь поверхностей микроорганизмов
4.3. Циготоксичные белки, формирующие амилоиды.
4.4. Амилоидные белки бактериальных биопленок
4.5. Амилоидный адгезии КС дрожжей i i
4.6. Амилоиды микроорганизмов и болезни
5. Заключение и постановка задач исследования
Материалы и методы.
1. Используемые в работе реактивы
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания.
3. Электрофорез в денатурирующих условиях
4. Вестернблотанализ.
5. Выделение клеточных стенок дрожжей
6. Частичная денрогеииизапия клеточных стенок
7. Эксгракция белков из предварительно биотинилированных клеточных стенок дрожжей .,
8. Выделение глюкантрансферазы 2 из клеточных стенок дрожжей.
9. Флуоресценция тиофлавина Т
. Спектроскопия кругового дихроизма
. I массспектрометрия .
. Микроскопические методы анализа
. Определение глюкаитрансферазной активности 2.
. Компьютерный анализ сгруктуры белков.
. Эксперименты над лабораторными мышами
.1. Введение мышам препаратов КС.
.2. Изучение двигательной активности и ориентировочноисследовательского поведения подопытных мышей
.3. Гистологические методы исследования
Результаты и их обсуждение
1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательное гей белков КС дрожжей
. vii.
2. Экспериментальное выявление белков КС, обладающих свойствами амилоидов
3. Краткий обзор литературы глюкантрансфераза 2 из КС дрожжей . vii.
4. Подбор условий выделения глюкантрансферазы 2 из КС дрожжей . vii
5. Характеристика свойств глюкантрансферазы 2
5.1. Компьютерный анализ последовательности 2
5.2. Экспериментальная характеристика свойств 2
5.3. Определение глюкантрансферазной активности 2.
5.4. Изменения в белковом составе КС, происходящие при делении гена 2
6. Исследование влияния инъекций суспензии КС на организм мышей.
Выводы.
Список цитируемой литературы


Выше мы упоминали, что амилоидные фибриллы, а также фибриллярные олигомеры, в отличие от других белковых агрегатов, не диссоциируют в присутствии денатурирующих агентов, в частности, додецилсульфата натрия Дс. Это позволяет выявлять присутствие амилоидных олигомеров методом электрофореза в полиакриламидном . ii . , или агарозном i , , ii, геле в денатурирующих условиях, который основан на определении подвижности белков в электрическом поле. Больший размер пор геля агарозы по сравнению с размером пор геля акриламида позволяет выявить белковые агрегаты с большей молекулярной массой. При изучении структуры метастабильных олигомеров, которые образуются на начальных этапах формирования амилоидных фибрилл, применяют различные химические агенты, которые формируют ковалентные сшивки между соседними мономерами, например, гомобифункциональное соединение глутаровый альдегид i , . Принцип метода основан на формировании Шиффого основания при присоединении глутарового альдегида к аминогруппам лизинов или концевым аминогруппам соседних мономеров в составе олигомера , . Также применяют фотохимическую сшивку олигомеров с использованием различных реагентов, в частности, дивалентных ионов рутения 2, которые при возбуждении светом с длиной волны 2 нм способны превращаться в ионы 3, и далее отнимать электрон у белковых молекул, генерируя свободные радикалы i, ii , . Сшивка олигомеров в данном случае идет по свободнорадикальному механизму. Преимуществом описанного метода является то, что белковые олигомеры конъюгируют мгновенно, что позволяет не только установить факт формирования олигомеров, но также изучить структуру образующихся при этом корогкоживущих переходных состояний. Для этого применяют методы, описанные ниже. Амилоиды характеризуются фибриллярной морфологией, отличающей их от других белковых агрегатов. Обычно амилоидные фибриллы имеют ширину не менее 5 нм, их длина является неопределенной, поскольку зависит от степени полимеризации амилоида. Кроме того, амилоидные фибриллы иногда формируют пучки диаметром более 0 нм . Для изучения морфологии белковых агрегатов, используют различные микроскопические методы. Чаще всего применяют варианты, электронной микроскопии, включая. ПЭМ образцов, высушенных на покрытых полимерной пленкой сеточках, и сканирующую электронную микроскопию СЭМ поверхностей i , . i . i . Эти методы основаны на рассеянии электронов на атомах образца. В ПЭМ регистрируются электроны, прошедшие сквозь ультратонкий менее нм толщиной образец, в СЭМ рассеянные на поверхности образца. При использовании метода СЭМ для изучения белковых агрегатов последние должны быть иммобилизованы на твердой подложке. Для повышения контраста изображения, полученного методом ПЭМ, объекты обрабатывают электронными красителями сильно рассеивающими электроны соединениями тяжелых металлов уранил ацетатом, нитратом олова и др. Связывание происходит восновном неспецифически, хотя, известно, что некоторые химические группы реагируют с указанными, ионами. Уранил ацетат активно взаимодействует с фосфатными и аминогруппами, олово связывается с отрицательно заряженными группами, такими как гидроксильные i, . В связи с этим зоны окрашенного с использованием уранил ацетата образца, содержащие преимущественно полисахариды, имеют меньшую электронную плотность, чем области, в которых превалируют белки последние содержат значительное число уранилсвязывающих групп. В методе СЭМ применяется оттснснис на образец в вакуумной установке напыляется тонкая пленка металла и т. i . Разрешение описанных методов, ограничено размерами металлических частиц, образующих тень, либо ионов тяжелых металлов, использующихся в качестве красителей, которые лишь грубо очерчивают поверхность, молекулы или макромолекулярного ансамбля. Однако в настоящее время можно наблюдать с высоким разрешением даже внутренние детали трехмерных структур, таких, как амилоидные фибриллы i . Vi . .