Очистка, физико-химические и регуляторные свойства изоформ аконитатгидратазы из гепатоцитов голодающих крыс

• Автор: Семенова, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 142 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Физиологическая роль, субклеточная локализация и изоферментный состав аконитатгидратазы
1.1.1. Физиологическая роль аконитатгидратазы в обеспечении функционирования различных физиологобиохимических процессов в живых организмах

1.1.2. Внутритканевая локализация и изоферментный состав аконитатгидратазы.

1.2. Очистка и каталитические свойства аконитатгидратазы.

1.2.1. Очистка аконитатгидратазы.

1.2.2. Физикохимические и каталитические свойства.

1.2.3. Регуляция и экспрессия аконитазной активности под влиянием различных факторов

1.3. Особенности метаболизма в живых организмах при пищевой депривации.

1.3.1. Гормональная регуляция энергетического метаболизма в организме.

1.3.2. Метаболические особенности различных органов в условиях продолжительного голодания
1.3.3. Изменение окислительных процессов в печени животных при голодании.
1.3.4. Протекание глюконеогенеза в организме млекопитающих в условиях пищевой депривации.
1.3.5. Связь глюконеогенеза с окислением жирных кислот в печени крыс при голодании
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Цель и задачи исследования
2.2. Объекты и методы исследования с
2.2.1. Объекты исследования
2.2.2. Методы исследования .с
2.2.2.1. Создание условий пищевой депривации.
2.2.2.2. Выделение изоформ аконитатгидратазы из тканей животных .
2.2.2.3. Методы чистки изоформ аконитатгидратазы
2.2.2.3.1. Фракционирование животного экстракта сульфатом аммония
2.2.2.3.2. Гельфильтрация на сефадексе С.
2.2.2.3.3. Ионообменная хроматография через ДЭАЭТоуореаг1.
2.2.2.3.4. Гельфильтрация на ТоуореаН . ,
2.2.2.4. Определение количества белка
2.2.2.5. Определение активности ферментов
2.2.2.6. Определение молекулярной массы и субъединичного строения изоформ аконитатгидратазы
. Электрофоретические исследования.
.2.1.1. Определение гомогенности очищенной аконитатгидратазы
2. Специфическое окрашивание аконитатгидратазы.
.2 Изоферментный состав аконитатгидратазы
2.1Л. Электрофорез в присутствии додеци л сульфата натрия
2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик фермента
2.2.3. Статистическая обработка результатов
2.3. Полученные результаты и их обсуждение.
2.3.1. Внутритканевое распространение аконитагидратазы.
2.3.2. Субклеточная локализация и изоферментный состав фермента в различных органах крыс.
2.3.3. Динамика, субклеточная локализация и изоферментный состав аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс.
2.3.3.1. Динамика активности аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации
2.3.3.2. Субклеточная локализация фермента
2.3.3.3. Множественные молекулярные формы аконитатгидратазы в гепатоцитах крыс.
2.3.4. Очистка изоформ аконитатгидратазы
2.3.5. Разработка условий хранения фермента.
2.3.6. Электрофоретические исследования гомогенности полученных ферментных препаратов аконитатгидратазы
2.3.7. Физикохимические и каталитические свойства акон итатги д ратазы.
2.3.7.1. Определение молекулярной массы и субъединичного строения акон ититгидрагазы.
2.3.7.1.1. Гельфильтрация на Тоуореаг1 НУ
2.3.7.1.2. Электрофорез в присутствии БяЫа.
2.3.7.2. Определение Кт.
2.3.7.3. Влияние среды на активность изоформ фермента
2.3.8. Метаболитная регуляция.
2.3.8.1. Влияние различных интермедиатов клеточного метаболизма на активность фермента.
2.3.8.2. Влияние перекиси водорода на работу изоформ аконитатгидратазы.
2.3.8.3. Роль железа в каталитическом действии фермента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в публикациях 9 статьях и 4 тезисах. Структура и обем работы. Диссертация изложена на 2 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы 2 источников. Иллюстрационный материал включает рисунков, таблиц. ГЛАВА 1. Аконитатгиратаза аконитаза, АГ, КФ 4. Главная ее роль в обеспечении функционирования цикла трикарбоновых кислот ЦТК, т. Катализируемая ею реакция взаимопревращения трех наиболее важных трикарбоновых кислот лимонной, цисаконитовой и изолимонной является одним из этапов цикла Кребса, который представляет собой центральное звено в процессах распада дыхательных субстратов и в процессах синтеза, ведущих к образованию белков, липидов и углеводов Страйер, , КарЫп е1 а1. РпБЬтап, Нетзе, . Атомы Н и ОН группа, отщепляемые АГ, обозначены . И.изоцитрат является субстратом аконитазы . Еще Питерс и Шортхауз , , , анализируя соотношение скоростей образования цисаконитата из цитрата и изоцитрата, пришли в выводу, что АГ представляет собой сложный комплекс с двумя независимыми каталитическими центрами один центр обладает цитратдегидратазной, второй изоцитратдегидратазной активностью. По мнению Глускера , АГ животных тканей имеет один активный центр. Автор объясняет это тем, что на разных стадиях очистки фермента соотношение скоростей катализируемых ферментом реакций практически не изменялось. Существование двух конформеров аконитазы, выделенной из сердца свиньи, обладающих разной каталитической активностью по отношению к цисаконитату и цитрату доказал Виллафранка Vi, . Его аргументация основывается главным образом на том, что многие ингибиторы вызывают неодинаковое торможение реакции при использовании различных субсгратов. При превращении цисаконитата в цитрат и изоцитрат может играть определенную роль окислениевосстановление железа в ферменте, главным звеном в механизме действия которого является образование аконитазо2субстратного комплекса. Наличие данного комплекса было доказано методами хлучевой кристаллографии и ПСЯМР i, , , , v . У ряда организмов установлено наличие реликтовых ферментов аконитазы, способных в отличие от нормальной полноценной АГ, катализировать только одну реакцию. Цитратдегидратаза могла диссоциировать в обычную АГ. О способности АГ к образованию полимерных комплектов сообщили в году японские исследователи i . Из микроорганизмов были получены 2 формы АГ, играющие различное физиологическое значение в метаболизме. Например, у i авторами они были названы ранняя и поздняя формы . Первая ранняя, проявляет наибольшую каталитическую активность в возрасте культуры 5 часов, вторая поздняя в возрасте часов. Ранняя форма АГ наиболее активна в тот период, когда большинствоорганических кислот утилизируется через ЦТК, а поздняя используется для анаболических целей в глиоксилатном цикле ГЦ. Во время ее наибольшей активности синтезируется триозофосфат и фруктозо1,6дифосфат, которые необходимы организму для построения компонентов бактериальной оболочки пепгидогликана и для синтеза v оболочки споры. Из определения констант Михаэлиса ранней и поздней АГ следует, что поздняя форма фермента имеет в 5 раз большее сродство к субстрату, чем, повидимому, подтверждается предположение о функциональном назначении различных форм фермента. Если раньше считалось, что у масличных, бактерий АГ участвует в функционировании ГЦ , , то в работах В. Н. Попова и С. В. Волвенкина с соавторами Попов и др. Волвенкин и др. ГЦ функционирует и в тканях высших животных, в частности, в гепатоцитах крыс в условиях пищевой депривации и при адаптации к искусственно созданному аллоксановому диабету. Основной его функцией является конденсация двух молекул ацетилСоА в четырехуглеродную органическую кислоту сукцинат, вследствие чего активизируются новые метаболические пути, мобилизирующие запасные липиды. Источниками ацетилСоА могут быть С. Токисление жирных кислот. В.Н. Поповым, С.