Хроматографическая очистка микробных пектиназ и целлюлаз и использование их при изолировании протопластов высших растений

• Автор: Хасирджева, Альбина Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . II

ГЛАВА I. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1.1. Структурные вещества клеточных стенок высших растений и характеристика ферментов, расщепляющих эти вещества . . II
1.2. Изолирование жизнеспособных протопластов растений под действием ферментных препаратов

ГЛАВА 2. НЕПОЛИТИЧЕСКИЕ И ЦЕЛЛЮЯОЛИТИЧЕСКИЕ КОМПЛЕКСЫ И МЕТОДЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ

2.1. Пектолитические и целлюлолитические

системы у микроскопических грибов .

2.2. Гельхроматография как эффективный

метод очистки белков и ферментов . .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Ферментные препараты как источник получения высокоактивных комплексов пектиназного и целлшазного действия .
3.2. Методы определения активности ферментов
3.2.1. Определение активности ферментов пектолитического комплекса
3.2.2. Определение активности целлюдаз . .
3.2.3. Определение активности ферментов, присутствующих в пектиназном и целлклазном комплексах ксиланаза, лихениназа, лами
нариназа, инвертаза, Vацетил рглюкозаминвдаза, цротеаза, амилаза .
3.3. Определение содержания белка, нейтральных сахаров и цветности в ферментных препара
3.4. Методы выделения и очистки пектиназных
и целлюлазных препаратов.
3.5. Методы биохимической характеристики очищенных ферментных препаратов
3.6. Выделение растительных протопластов .
ГЛАЗА 4. РАЗРАБОТКА НОШХ ПРИЕМОВ ГЕЛЬХРОМАТОГРАФИИ НА АКРИЛЕКСЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ И ЦЕШИОЛОЛИТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ .
4.1. Влияние концентрации белков и солей на структуру зерен полиакриламидного геля
в статических условиях.
4.2. Влияние вязких концентрированных растворов
на структуру геля при хроматографии на колонках.
4.3. Изучение режима гельхроматографии концентрированных ферментных растворов .для масштабирования процесса очистки
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ПРЕПАРАТА ПЕКГИНАЗЫ ПЕКТИНАЗА0 НА ОСНОВЕ ГЕЛЬХРОМАТОГРАФИИ
5.1. Испытание разных приемов очистки пектолитического комплекса из препаратов пектофоетидина ПГОх и пектофоетидина ГЗх .
5.2. Получение высокоактивного пектолитического препарата по разным схемам и их сравни
тельная оценка
5.3. Характеристика компонентного состава препарата пектиназа0 в сравнении с пектиназой мацерозим В
5.4. Разделение ферментного комплекса пектиназы0 гельхроматографией на ультрагеле АсА.
5.5. Разделение пектиназы0 методом изоэлектрического фокусирования и определение изоэлектрических точек отдельных компонентов
5.6. рНзависимостъ энцополигалактуроназы как основного компонента пектиназного комплекса, ответственного за процесс мацерации растительной ткани
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНОГО ЦЕЛЛКШОЛИТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЦЕЛЛКШАЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЕЛЬХРОМАТОГРАФИИ
6.1. Испытание целлшолитических препаратов целлоконингия ПЮх, целлолигяорин ПГОх,
целловирвдия ГЗх, целлокандин ГЗх цри очистке их концентрированных растворов гельхроматографией .
6.2. Получение высокоактивного целлаполитического препарата из целлокацдина ГЗх по разным схемам и их сравнительная
оценка.
6.3. Характеристика компонентного состава
препарата целлгааза в сравнении с
целляшазой Онозука В. III
6.4. Изучение влияния на целлюлазную активность препаратов целлкшаза и Онозука К ИЗ
6.5. Стабильность высокоактивных целлкшолитичбских препаратов, полученных из целлокандина ГЗх, при хранении
ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ И ПОДБОР УСЛОШЙ ДЛЯ ВЬЩЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОТОПЛАСТОВ С ПОМОЩЬЮ ПЕКТИНАЗЫ0 И
ЦЕЛЛЮЛАЗЫЮОО
7.1. Замена японского препарата мацерозим К на препарат пектиназа0 в методике выделения протопластов .
7.2. Замена японского препарата целлшазы Онозука Е на препарат целлтазаГСОО при выделении протопластов .
7.3. Получение жизнеспособных растительных протопластов с помощью двух препаратов пектиназы0 и целлюлазыЮОО
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Изучение влияния интенсивных факторов концентрации растворов, скорости элюирования, размеров колонок на сжимаемость геля типа акрилекс и условий его регенерации позволило достигнуть многократного использования гелевой колонки объмом л и хорошей воспроизводимости хроматографического процесса. На способ хроматографической очистки получено авторское свидетельство . На основе гельхроматографии разработаны схемы групповой очистки пектиназных и целлюлазных комплексов и получены новые высокоактивные ферментные препаратыбиохимреактивы пектиназа0 и целлшаза. На способ получения пектолитического препарата получено авторское свидетельство . Впервые охарактеризован состав пектиназы0 и целлюлазы по компонентам, их изоэлектрическим точкам и молекулярным массам. Изучены сочетания ферментных отечественных и зарубежных препаратов пектиназы0, целлюлазыЮОО, мацерозима В и целлкшазы Онозука В при действии на листовую ткань табака как модельный растительный объект. Показало, что полученные нами препараты пектиназа0 и целлшаза обеспечивают хорошее изолирование жизнеспособных цротопластов, а также выделение отдельных клеток растительных тканей. Практическая ценность работы заключается в разработке и внедрении способа гелевой хроматографии высококонцентрированных ферментных растворов в интенсивном режиме, пригодного для очистки любых ферментов и других высокомолекулярных соединений от солей и низкомолекулярных примесей. Разработанный способ хроматографической очистки положен в основу схемы получения высокоактивных препаратов пектиназы и целлшазы, внедрнной на Московском опытном заводе ферментных препаратов. Созданы два новых отечественных биохимреактива пектиназа0 и целлшазаЮОО, и разработана эффективная методика изолирования жизнеспособных протопластов высших растений с использованием этих препаратов. Показано, что препараты пектиназа0 и целлшазаЮОО могут быть с успехом использованы вместо зарубежных аналогов при выделении клеток и цротопластов высших растений. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. I.I. Клеточная оболочка высших растений представляет собой химически сложную трхмерную структуру, в которой различают первичную и вторичную клеточную стенку и межклеточное вещество срединную пластинку. Общими чертами в структурообразовании клеточной оболочки всех высших растений является наличие таких полимерных соединений, как целлюлозные фибриллы, гемицеллюлозы, пектиновые вещества и др. Соотношение отдельных названных полимеров может меняться в широких пределах в зависимости от вида растения, разных их тканей, а также фазы развития. Так, целлюлозные и особенно лигниновые компоненты накапливаются на более поздних фазах развития растительного организма. Это обстоятельство является существенным для ферментативной обработки ткани, так как целлюлозные волокна и лигнин являются наиболее трудно гидролизуемыми растительными полимерами. Лигнин по своему строению и свойствам резко отличается от основных компонентов растительной ткани целлюлозы и гемицеллюлозы. В зависимости от происхождения лигнины заметно отличаются друг от друга. Их наличие првдат тканям растений большую устойчивость к действию ферментов, поэтому старые ткани не пригодны для получения протопластов. Рис. Модель клеточной стенки по данным Альберсхейма с сотрудниками а. Легкогидролизуемые компоненты, такие, как пектиновые вещества, гемицеллшозы, сами по себе является многоструктурными веществами и состоят из широкого набора полисахаридов, содержащих белковые включения. В межклеточном веществе срединных пластин на ранних стадиях развития растения преобладают более однородные пектиновые вещества, содержащие кислый полисахарид, называемый полигалактуроновой кислотой, карбоксильные группы которой обычно большей частью бывают метилированы. На этот полисахарид действуют два типа ферментов, способных в одном случае расщеплять о. Несмотря на разный химический механизм расщепления гликозцдной связи, результат получается одинаковым деполимеризация субстрата. Следствием этого является разрушение растительной ткани мацерация с образованием изолированных клеток, поэтому ферменты, вызывающие такой распад, называют мацерирующими Бравова, Самойлова, . Рис.