Экзо-инулиназа из Aspergillus awamori 2250 : Структурно-функциональные исследования

• Автор: Кульминская, Анна Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 107 с. : ил.

РоПкагроу, Бразилия, за плодотворное сотрудничество по теме данной работы, полезное обсуждение результатов и содействие в подготовке публикаций. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Молекулярная и клеточная биология Президиума РАН и Российского фонда фундаментальных исследований проекты 6, 1. Теоретическое и практическое значение работы. Фруктаны. Природные источники, функции и строение фруктанов. Инулин распространение в природе, строение, свойства, биологическая роль и применение. Микробные инулиназы. Современные представления о классификации гликозидгидролаз. Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз. Построение субсайтной модели активного центра экзодействующих гликозидгидролаз. Условия роста культуры и выделение экзоинулиназы. Субстраты. Общие методы. Анализ Мконцевой и внутренних фрагментов аминокислотной последовательности. Измерение активности экзоинулиназы. Методы анализа каталитических свойств инулиназы. Метод, анализа кинетических параметров реакций гидролиза экзоинулиназой. Метод, определения аффинностей субсайтов активного центра фермента. Определение констант ингибирования фруктоолигосахаридами реакции гидролиза сахарозы. Методы исследования трансгликозилирующей активности экзоинулиназы. НЯМРспектроскопия продуктов гидролиза инулина. Выделение нуклеиновых кислот и клонирование ииулиназного гена и к ДНК методом ПЦР. Выделение РНК из А. Получение кДИК гена А. Выделение и физикохимические характеристики экзоинулиназы. Характер действия экзоинулиназы. Кинетические параметры гидролиза различных субстратов экзоинулиназой. Определение констант ингибирования реакции гидролиза сахарозы фруктоолигосахаридами. Исследование трансгликозилирующей активности экзоинулиназы. Анализ гена и кДНК экзоинулиназы. Исследование углеводного компонента экзоинулиназы и его влияние на кристаллизацию. ФОС с. К.Ф. Актуальност, проблемы. Одним из наиболее перспективных направлений развития биотехнологии является использование биологических катализаторов химических реакций ферментов. Это направление предполагает применение как очищенных природных ферментов, так и их рекомбинантных аналогов, свойства которых в настоящее время могут быть модифицированы в нужном направлении при помощи генноинженерных подходов, В современной промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз гликозидгидролазы гликозидазы, К. Ф. 3. Эти ферменты катализируют расщепление гликозидных связей между двумя сахаридными остатками или углеводным и агликоновым компонентами. Одной из причин пристального внимания к этой руппе ферментов является то, что гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих биологически значимых гликозидов, олигосахаридов и гликоконыогатов. Такое их применение основано на том факте, что некоторые гидролазы способны обращать при определенных условиях реакции гидролиза в направлении формирования новых гликозидных связей. Ферментативный синтез имеет значительные преимущества перед традиционными методами органического синтеза, так как позволяет получать необходимые соединения практически в одну стадию и без проведения реакций блокирования и деблокирования реакционноспособных групп. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удастся получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Поэтому получение данных о взаимосвязи строения активных центров этих ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующей реакции, несомненно, важно, т. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств и как белков, и как ферментов, а также знаний первичной структуры и строения соответствующих генов. Полная совокупность фундаментальных знаний о каждом конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с производственными задачами. Среди гликозидаз выделяется группа микробных инулипаз, которые являются важными промышленными ферментами.