Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе

• Автор: Барановский, Андрей Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 130 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Каталитически активные антитела

1.1.1. Искусственные абзимы

1.1.2. Природные абзимы Ю

1.1.2.1. Абзимыпротеазы

1.1.2.2. Абзимынуклеазы

1.1.2.3. Природные абзимы с другими активностями

1.1.2.4. Механизмы возникновения КА АТ

1.1.2.5. Биологическая роль КА АТ

1.2. Рассеянный склероз

1.3. Дезоксирибонуклеазы человека

1.3.1. ДНКаза I
1.3.2. ДНКаза И
1.3.3. Фосфодиэстераза I
1.3.4. ДНКаза
1.3.5. Эндонуклеаза
1.3.6. Лактоферрин
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Исследуемая группа больных рассеянным склерозом и группы сравнения
2.2.2. Получение сульфатаммонийного осадка белков крови
2.2.3. Выделение антител крови аффинной хроматографией на i
2.2.4. Выделение антител из спинномозговой жидкости
2.2.5. Очистка I с помошыо гельфильтрации и ионообменной хроматографии
2.2.6. Аффинная хроматорафия I на ДНКцсллюлозе
2.2.7. Концентрирование препаратов белка
2.2.8. Определение концентрации белка
2.2.9. Электрофоретический анализ белков
2.2 Перенос белков на нитроцеллюлозиую мембрану и окрашивание
коллоидным раствором серебра
2.2 Иммуноферменгное окрашивание I и их субъединиц
2.2 Синтез конъюгатов кролика против легких и тяжелых цепей
человека с псроксидазой хрена
2.2 Проведение рПшока для препаратов антител
2.2 Исследование взаимодействия ДНКабзимов с аффинными сорбентами
2.2 Разделение молекул с легкими цепями к и Хтипа
2.2 Получение и очистка 1аЬфрагментов
2.2 Выделение ДНКазы I человека
2.2 Выделение ДНКазы II человека
2.2 Получение и очистка ДК плазмиды рВЫсяспрг
2.2 Получение и очистка 5Рмеченых олигонуклеотидов
2.2 Определение активности антител в реакции гидролиза ДНК плазмиды рВ1ие5СПр
2.2 Экспрессоценка ДНКгидролизующей активности антител
2.2 Определение активности ДНКаз в реакции гидролиза ДНК плазмиды рВ1ие8СПр
2.2 Определение активности ДНКаз по Кунитцу
2.2 Исследование рИзависимости реакции гидролиза ДНК препаратами и ДНКаз
2.2 Исследование металлзависимости реакции гидролиза ДИК препаратами 1цС и ДНКаз
2.2 Исследование кислотолабильности абзимов и ДКаз человека
2.2 Исследование термостабильности вабзимов и ДНКаз человека
2.2 Исследование гидролиза дезоксирибоолигонуклеотидов препаратами и
ДНКаз человека
2.2 Тестирование нуклеазной активности и геле
2.2 Определение кинетических параметров реакции гидролиза олиг онуклеотидов препаратами
2.2 Определение активности антител в реакции гидролиза полирибонуклеотидов и сСМР
2.2 Определение РНКазной активности антител в реакции гидролиза рЦю методом кислотонерастворимых осадков
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение препаратов антител из крови человека
3.2. Скрининг ДНКгидролизующей активности в препаратах антител
А 3.3. Доказательство наличия у антител крови больных рассеянным склерозом
каталитических функций
3.3.1. Кислый шок препаратов антител
3.3.2. Связывание ДНКгидролизующих антител аффинными сорбентами
3.4. Получение высокоочигденных препаратов из крови больных рассеянным склерозом
3.5. Взаимодействие ДНКабзимов с ДНКцеллюлозой
3.6. Выделение ДКаз из мочи человека
3.7. Определение оптимальных условий гидролиза ДНК препаратами 0 и ДНКаз человека
3.7.1. Исследование металлзависимости
3.7.2. Исследование рНзависимости
3.8. Сравнение и тсрмостабильности ДКабзимов и ДНКаз человека
3.9. Локализация активного центра ДНКгидролизуюших антител при рассеянном склерозе
3.9.1. Определение типа легких цепей ДНКабзимов
3.9.2. Каталитическая активность РаЬфрагментов
3.9.3. Тестирование ДНКгидролизующей активности антител т нш
ЗЛО. Исследование гидролиза дсзоксирибоол и гону клео гидов препаратами и
ДНКазами человека
3 Кинетические характеристики реакции гидролиза ДНК препаратами
3 Сравнение субстратной специфичности препаратов антител и РНКаз
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ


Среди таких подходов можно выделить следующие фаговый дисплей, сайтнаправленный мутагенез, селективная химическая модификация, создание генноинженерных конструкций и т. К настоящему времени описано более 0 реакций, катализируемых абзимами в их числе перегруппировка Кляйзеиа, гидролиз аминов и эфиров, дскарбоксилирование, реакция ДильсаАльдера, причем для ряда реакций не известны соответствующие ферменты. По каталитической эффективности некоторые абзимы не уступают ферментам с аналогичной активностью, а по специфичности даже превосходят их. Следует отметить, что у абзимов с наилучшими каталитическими характеристиками механизм катализа и организация активного центра зачастую оказывались идентичными таковым аналогичных ферментов. Конструирование АТ с заданными каталитическими свойствами имеет огромный спектр возможностей в биотехнологии и медицине. Одним из актуальных направлений является получение абзимов, катализирующих быстрое расщепление вредных для человека соединений, включая различные яды и наркотики. В г. ВИПгидролизующих было показано, что КААТ можно получить иммунизацией субстратом реакции . Кроме того, иммунизация ферментом может привести к появлению абзимов с аналогичным типом активности, что было впервые показано для ацетилхолинэстеразы . Вышеизложенные факты свидетельствуют о том, что иммунная система млекопитающих потенциально способна продуцировать КААТ, которые в большинстве своем катализируют простые односубстратиыс реакции. Первые попытки обнаружить каталитическую активность в препаратах АТ были сделаны еще в х г. Однако наиболее убедительные данные о существовании природных абзимов каталитических антител, продукция которых в организме не была индуцирована какимилибо внешними воздействиями, были получены в течение последних лет. В году С. Пол с соавт. ВИН из сыворотки крови больных бронхиальной астмой обладают протеолитичсской активностью . Бронхиальная астма представляет собой аутоиммунное заболевание, для которого характерно присутствие в крови больных высокоаффинных I к звенному нейропептиду, широко представленному в центральной и периферической нервной системе. В данной работе было показано, что доля КААТ составляет очень малую часть от общего содержания АТ, которая в случае ВИПабзимов оказалась меньше 0. При определении положения сайтов гидролиза оказалось, что картина расщепления ВИП абзнмами зависит от донора. В одном случае гидролизовалась только связь i , тогда как в двух других случаях число расщепляемых связей равнялось 6 7, и в основном они локализовались на участке с го по ой АК остаток , . Интересно отметить, что атакуемые пептидные связи соединяли аминокислоты разного размера, заряда и гидрофобности. Исследованные ВИПабзимы не гидролизовали пептиды или белки, отличающиеся но последовательности от ВИП, что указывало на их исключительную селективность . Значения Кт в реакции гидролиза ВИП различными
препаратами АТ находились в диапазоне 3. М, что говорит о значительно более прочном связывании абзимов с субстратом по сравнению с известными протеазами. При исследовании роли отдельных субъединиц ВИПабзимов в катализе реакции ирогсолитического расщепления оказалось, что активный центр таких аутоантитсл формируется легкой цепыо, в то время как тяжелая цепь отвечает за прочное связывание с субстратом . Эффективность гидролиза ВИП с помощью изолированной легкой цепи была значительно выше, чем при гидролизе субстрата интактными I или их фрагментом, однако сайтспецифичность оставалась прежней. В последующем было показано, что белки БенеДжонса легкие цепи антител, обнаруживаемые в моче больных множественной миеломой имеют выраженную протеолитическую активность в отношении ВИП и коротких метилкумариновых пептидов . У больных множественной миеломой также были обнаружены легкие цепи АТ, специфически расщепляющие протромбин и белок оболочки вируса иммунодефицита человека , . Последний пример указывает на то, что природные каталитические антитела могут быть направлены не только на собственные антигены организма. При иммунизации мышей конъюгатом ВИП с белкомносителем были получены моноклональные АТ с моноспсцифичной ВИПгидролизующсй активностью .