Получение и иммунохимический анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина

• Автор: Павлов, Константин Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление
Оглавление.

Список использованных сокращений.

Введение

Глава I. Обзор литературы.

1.1. АР глиофибриллярный кислый протеин

1.2 Иммуноферментые системы для количественного определения антигена в

биологических жидкостях.

1.3 Диагнстическая ценность количественного определения вРАР в биологических жидкостях.

1.4 Заключение

Глава 2. Материалы и методы исследовании.

2.1 Методы молекулярной биотехнологии.
2.1.1 Полимеразная цепная реакция
2.1.2 Применение эндонуклеаз рестрикции в технологии рекомбинантных ДНК
2.1.3 Плазмидные вектора и лигирование вставки.
2.1.4 Экспрессия трангенных белков в прокариотической системе
2.1.5 Выделение рекомбинантных белков имеющих в своем составе гексагистидиновый мотив.
2.1.6 Метод аналитического дискэлектрофореза в полиакриламидном геле
2.2 Иммунохимические методы.
2.2.1 Метод иммунодиффузионного анализа
2.2.2. Метод иммуноблот анализа
2.2.3 Методы иммуноморфологического анализа
2.2.4 Метод твердофазного иммуноферментного анализа для количественного определения белков
Глава 3. Результаты собственных исследований.
3.1 Клонирование и экспрессия вРАР в вектор реа и экспрессия в штамме ОЕЗВК. Иммунохимическая характеристика рекомбинантного вРАР
3.2. Получение и иммунохимическая характеристика моно и поликлональных антител, полученных путем иммунизации рекомбинантным препаратом вРАР.
3.3. Разработка сэндвич варианта ИФА анализа для количественного определения
концентрации вРАР в биологических жидкостях.
Глава 4. Обсуждение полученных результатов.
Глава 5. Выводы.
Список литературы


По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ 4 в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, 1 глава в монографии . Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы отражающей результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы 0 источников из них 4 отечественных и 6 зарубежных авторов. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично. Глава 1. Обзор литературы. глиофибриллярный кислый протеин. ii ii i глиофибриллярный кислый протеин является белком промежуточных филаментов и экспрессируется преимущественно в астроглиальных клетках нервной системы. История изучения глиофибртшлярного антигена близко связана с исследованиями группой . спектра липидов в ткани мозга пациентов, страдающих рассеянным склерозом. Как известно, рассеянный склероз является заболеванием центральной нервной системы и характеризуется демиелинизацией, интенсивным реактивным глиозом и формированием рубца на месте лишенных аксональной миелиновой оболочки нейронов. Группа . применяла традиционные биохимические методы для изучения белков, входящих в состав склеротических бляшек. После гомогенизации и делипидизацип белки растворяли в феноле с муравьиной кислотой и подвергали препаративному элекгрофорезу. Белки, экстрагированные из отдельных белковых зон, использовались для иммунизации кроликов с целью получения поликлональных антисывороток. Было обнаружено, что поликлональные антитела, полученные при иммунизации лабораторных животных белком с молекулярной массой кДа, позволяют обнаруживать астроциты при иммуногистохимическом изучении ткани головного мозга. Выделенный впоследствии белок был назван глиофибриллярньтм кислым протеином . Идентификацию и изучение затрудняли его малая растворимость в водных растворах, склонность к агрегации и полимеризации, восприимчивость к нейтральным протеазам. Характерно, что лишь относительно малые количества можно обнаружить в растворимой форме в нормальном головном и спинном мозге и в культурах астроцитов. Низкомолекулярные, растворимые формы ОБ АР в этих случаях, повидимому, являлись продуктами действия тканевых протеиназ. Однако уже в году в нейрохимической лаборатории Стэнфордского медицинского центра был определен полный аминокислотный состав белка, позднее идентифицированного как ОБ АР. Результаты исследования были представлены на втором симпозиуме Международного общества нейрохимии в Милане 2. Аминокислотный состав вРАР характеризуется относительно большим содержанием остатков моноаминодикарбоновых аминокислот аспарагиновой и глутаминовой, а также лейцина, глицина и аланина, что хорошо согласуется с значениями изоэлекпрической точки при 5,75,9 и высокой анионообменной способностью. Иконцевым остатком является аланин или блокированный метионин. Сравнение первичной структуры СРАР с аминокислотными последовательностями двух других представителей группы белков промежуточных филаментов виментином и десмином выявило их гомологичность на и , соответственно 2. Получение очищенного препарата ОРАР позволило изучить его физикохимические свойства 5. РАР экстрагируется из тканей хлороформнометанольными смесями без существенных изменений иммунохимических характеристик 4. Водорастворимая фракция ОРАР извлекается из ткани мозга фосфатным буфером в количестве от его общего содержания в ткани. РАР стабилен в экстракте при многократном замораживании и оттаивании в течение часовой инкубации при С, а также при минутном кипячении. Из растворов он легко осаждается 2,5ной трихлоруксусной кислотой, сульфатом аммония при концентрациях последнего, превышающих насыщения, а также при изменении раствора до области изоэлектрической точки. БАР активно связывается с анионообменниками, элюируясь с них при 00 мМ ИаС1.