Пространственно-временная динамика тромбообразования при диффузии тромбина в нерекальцифицированную плазму

• Автор: Красоткина, Юлия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Коагуляционное звено системы гемостаза
1.2. Ингибиторы свертывания крови
1.2.1. Структура и механизм действия антитромбина III
1.2.2. Структура и механизм действия протеина С
1.3. Формирование и лизис фибринового сгустка
1.4. Пространственные аспекты свертывания крови
1.5. Экспериментальное исследование пространственно-временных 27 характеристик процесса свертывания крови
Глава 2. Материалы и методы
Глава 3. Результаты
3.1. Динамика роста фибриновых тромбов в плазме и растворе 48 фибриногена
3.2. Влияние антитромбина III и фибринолитической системы на динамику 53 роста тромба
3.3. Проницаемость фибринового тромба для тромбина
3.4. Пространственная динамика тромбообразования при диффузии 57 тромбина в цитратную плазму
3.5. Динамика образования АМС и пространственное распределение 60 тромбина-НТС в цитратной плазме и растворе фибриногена
3.6. Влияние пептида, отщепляемого от протеина С при его активации 66 тромбином, на активность тромбина по отношению фибриногену
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

Список сокращений
АМС - 4-метил-7-аминокумарин
AT III - антитромбин III
BMK - высокомолекулярный кининоген
ГНЦ РАМН - Государственное некоммерческое учреждение
“Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук”
КНЦ РАМН - Кардиологический научный центр Российской академии медицинских наук сх2-МГ - аг-макроглобулин FII - протромбин Fllg - тромбин F V - фактор V F VII - фактор VII F VIII - фактор VIII F IX - фактор IX F X - фактор X F XI - фактор XI F XII-фактор XII F XIII-фактор XIII LED - светодиоды
РАИ - ингибитор активатора плазминогена 1 PAI2- ингибитор активатора плазминогена 2 PC - протеин С PS - протеин S
t-PA - тканевой активатор плазминогена TF - тканевой фактор
TFPI - тканевой ингибитор внешнего пути свертывания

ВВЕДЕНИЕ
Свертывание крови выполняет две задачи. С одной стороны, гемостатический тромб должен образовываться быстро, чтобы эффективно защитить организм от кровотечения. С другой стороны, процесс свертывания должен быть строго локализован в месте повреждения сосуда, для предотвращения тромбозов. Нарушения в коагуляционной и противосвертывающей системах приводят к серьезным заболеваниям. Недостаточное тромбообразование вызывает геморрагии [39,44], а неконтролируемое свертывание является причиной тромбозов и эмболий [171,60]. Поэтому изучение развития и остановки коагуляционного процесса является одной из важных задач современной биологии и медицины.
Механизмы, обеспечивающие быстрое образование фибрина - основы гемостатического тромба, достаточно хорошо и подробно изучены в настоящее время [4]. Известно, что каскадная организация системы свертывания, при которой каждый активный фактор является продуктом предыдущей ферментативной реакции, приводит к многократному усилению инициирующего сигнала [171]. Кроме того, коагуляционный процесс является самоускоряющимся, благодаря наличию в системе обратных положительных связей [14].
Что касается локализации свертывания, то, как показал анализ литературы, посвященной этой проблеме, вопрос о механизмах ограничения роста тромба остается до сих пор спорным. Более того, сравнительно недавнее открытие реакций активации фактора XI тромбином [36,124] и самоактивации фактора X [93] сделало очевидной возможность самоподдерживающегося -автоволнового - способа распространения свертывания, при котором такие ингибиторы, как антитромбин III и система протеина С, не могут остановить рост тромба [19]. Учитывая, что в настоящее время уже существуют теоретические [181] и экспериментальные исследования [1], результаты которых свидетельствуют в пользу автоволнового механизма распространения свертывания, проблема локализации тромбообразования приобретает особую актуальность.
Пространственно неоднородный процесс остановки роста тромба можно исследовать только в пространственно распределенной системе. В гомогенной

ридере.
Количество АТ III в нормальной плазме принималось за 100 %.
2.2.4. Определение количества протеина С в плазме
Концентрацию протеина С измеряли флюориметрическим методом с использованием субстрата БШ-Рго-Агд-АМС. Предварительно измеряли фон активности плазмы для этого субстрата. Для этого 50 мкл плазмы и 1925 мкл 50мМ имидазольного буфера pH 7.4, содержащего 0.1% РЕБ-бООО инкубировали в течение 15 мин. при 37°С. После этого к пробе добавляли 25мкп 50 мМ раствора субстрата БШ-Рго-Агд-АМС в ЭМБО и измеряли скорость увеличения интенсивности флюоресценции на спектрофлюорометре “ЗоЬеп-К/оп” (Франция).
Затем 50 мкл плазмы инкубировали со 100 мкл активатора протеина С в течении 15 мин при 37 °С. Затем добавляли 1825 мкл 50мМ имидазольного буфера pH 7.4, содержащего 0.1% РЕБ-бООО и инкубировали 3 мин при 37°С. После чего добавляли 25мкл 50мМ раствора субстрата БШ-Рго-Агд-АМС в РМБО и измеряли скорость увеличения интенсивности флюоресценции на спектрофлюорометре. Значения интенсивности флюоресценции пересчитывали в концентрацию активного фермента используя количественную калибровку сигнала по 1 мкМ-ому раствору АМС и значения кинетических констант для данного субстрата при реакции с протеином С: Км=688цМ, Кса1= 140сек-1 [100].
2.2.5. Приготовление плазмы, обедненной по антитромбину III и протеину С
АТШ и протеин С удаляли из объединенного пула бедной тромбоцитами плазмы здоровых доноров, используя аффинный иммуносорбент с антителами козы к АТШ или протеина С человека, иммобилизованными на ВгСЫ-Бербагове 4В (см п.2.2.2). После однократного пропускания 1 мл плазмы через 0.5 мл аффинного сорбента концентрация АТШ составляла не более 5%, а концентрация протеина С не более 3% от начальной.