Поиск способов стабилизации ферментов с целью повышения эффективности технологических биоорганических катализаторов (на примере дрожжевой бета-галактозидазы)

• Автор: Лайдсаар, Рейне Бадриковна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Таллин
• Количество страниц: 141 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Постановка задачи

1.2. Аннотация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Конформационная стабильность глобулярных ферментов

2.2. Термоинактивация ферментов с четвертичной структурой .

2.3. Методы стабилизации ферментов .

2.4. Физикохимические свойства р галактозидазы

2.5. Применение Р галактозидазы .

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Использованные реактивы и препараты .
3.2. Использованная аппаратура .
3.3. Методы проведения экспериментов .
3.3.1. Определение активности р галактозидазы
3.3.2. Определение термоинактивации р галактозидазы
3.3.3. Микрокалориметрическое определение изменения энтальпии .
3.3.4. Иммобилизация р галактозидазы на
. органических носителях .
3.3.5. Иммобилизация Р галактозидазы включением в полиакриламидный гель
3.3.6. Определение концентрации белка
3.3.7. Математическая обработка экспериментальных данных .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
4.1. Характеристика дрожжевой р галактозидазы
4.1.1. Изучение зависимости активности дрожжевой р галактозидазы от температуры и .
4.1.2. Зависимость удельной активности р галактозидазы от концентрации белка при разных температурах .
4.1.3. Ингибирование дрожжевой р галактозидазы галактозой
4.2. Диссоциативная термоинактивация дрожжевой
галактозидазы
4.2.1. Изучение термоинактивации дрожжевой
Р галактозидазы при различных концентрациях белка
4.2.2. Влияние сахаров на термостабильность дрожжевой Р галактозидазы
4.2.3. Влияние модификации дрожжевой р галактозидазы глиоксалем на диссоциативную термоинактивацию .
4.2.4. Термоинактивация Р галактозидазы в присутствии р меркаптоэтанола .
4.3. Разработка методов иммобилизации дрожжевой
6галактозидазы
4.3.1. Разработка методов иммобилизации дрожжевой Р галактозидазы на органических носителях
4.3.2. Разработка методов иммобилизации дрожжевой р галактозидазы включением белка в полиакриламидный гель .
4.3.3. Характеристика иммобилизованных препаратов дрожжевой р галактозидазы
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА .
I. ВВЕДЕНИЕ
1.1 Постановка задачи
Расширение и углубление научных исследований в области биотехнологии является одной из важнейших задач советской науки. Одним из наиболее перспективных направлений биотехнологии следует считать инженерную энзимологию технологический катализ с помощью иммобилизованных ферментов. Практическое применение ферментов, однако, до сих пор ограничивается сравнительно низкой стабильностью ферментных препаратов. Поэтому изучение механизмов инактивации ферментов составляет научную основу стабилизации ферментов и является одной из важнейших задач инженерной энзимологии. Особый интерес представляет изучение термостабильности ферментов с четвертичной структурой, так как процессы диссоциацииассоциации влияют на стабильность изучаемых препаратов и их кинетические свойства в процессе термической инактивации.
Использованию ферментов в пищевой промышленности отводится важное место при реализации решений Продовольственной программы СССР. В связи с задачами, вытекающими из Постановления ЦК КПСС и Совета Министров СССР о мерах по улучшению использования обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки, актуальное значение приобретает изучение фермента р галактозидазы, катализирующей реакцию гидролиза галактозидов, в том числе и молочного сахара лактозы.
В настоящее время в молочной промышленности поставлена за
дача резкого увеличения производства обезжиренного молока, пахты и молочной сыворотки. В Советском Союзе промышленность ежегодно получает млн. т обезжиренного молока и пахты и млн. т молочной сыворотки. К началу одиннадцатой пятилетки промышленная переработка сыворотки достигла 3,4 млн. т, т.е. перерабатывается только ценного молочного сырья.
В текущей пятилетке предусмотрено резко увеличить производство сухой и сгущенной сыворотки, к которым проявляют большой интерес со стороны предприятий пищевой промышленности. Однако сгущенные концентраты из сыворотки имеют специфический недостаток слишком высокое содержание лактозы. Кристаллизуясь, она выпадает при хранении в осадок, что снижает товарные качества продукта. Не сбраживаясь пекарскими дрожжами, лактоза может только ограниченно вноситься в хлебобулочные и кондитерские изделия и в корма для сельскохозяйственных животных.
Устранить отмеченные недостатки молочных концентратов можно путем полного или частичного гидролиза лактозы до моносахаридов глюкозы и галактозы. Это повышает сладость продукта, его стойкость к кристаллизации и улучшает питательные свойства.
Концентраты гидролизованной сыворотки можно с успехом применять в хлебопечении для улучшения качества хлеба и экономии муки и сахара в кондитерской промышленности при производстве напитков в мясной промышленности в заменителях цельного молока для сельскохозяйственных животных и в производстве кормовых продуктов.
Применение уЗ галактозидазы имеет особое значение для лечения людей с лактозной недостаточностью и при получении продуктов детского и диетического питания с более усваиваемым углеводным составом.
Для гидролиза лактозы на практике используют грибную, бактериальную и дрожжевую Р галактозидазу. С практической точки зрения наиболее изученной является грибная у5 галактозидаза, пригодная по своим энзиматическим свойствам для обработки лактозы в сыворотке молока, в частности, в творожной сыворотке. Учитывая значения рНоптимума фермента для гидролиза лактозы в цельномолочных продуктах и обезжиренном молоке, а также в подсырной сыворотке, более целесообразно применять Р галактозидазу дрожжевого происхождения. Однако технологическое применение дрожжевой уЗ галактозидазы до сих пор затруднено ее низкой стабильностью.
В связи с вышеуказанным, проблему изучения механизмов инактивации и термоинактивации дрожжевой Р галактозидазы следует считать весьма актуальной. Решение этого вопроса имеет большое практическое значение.
Целью настоящей работы явилось исследование кинетики термоинактивации р галактозидазы из дрожжей 1иуеготрС
, выяснение механизма и причин инактивации фермента, изучение на этой основе возможностей стабилизации его активной четвертичной структуры и разработка методов получения стабильных препаратов дрожжевой р галактозидазы.
Постановка настоящей работы связана с выполнением целевой комплексной программы 0, задания Исследование возможностей целенаправленного изменения каталитических свойств ферментов путем их химической модификации, включая иммобилиза
цию их разными методами
Автор выражает глубокую благодарность проф. О.М.Полтораку и д.х.н. Е.С.Чухрай из Московского государственного университета за ценные советы при теоретическом анализе экспериментальных данных.
1.2. Аннотация
Актуальность


Поэтому изучение механизма термоинактивации и стабилизации дрожжевой р галактозидазы относится к актуальным проблемам современной инженерной энзимологии. Цель работы. Научная новизна работы. На основании полученных в работе данных установлена двухстадийная кинетическая схема диссоциативной термоинактивации р галактозидазы в растворе, выяснен механизм ее термоинактивации и определены все кинетические константы этого процесса. Найдено и охарактеризовано стабилизирующее действие на фермент галактозы, глюкозы и лактозы, а также р меркаптоэтанола. Установлено, что инактивация уЗ галактозидазы в растворе связана с окислением 5Н групп, ответственных за формирование активной четвертичной структуры фермента. Практическое значение работы. Предложен способ иммобилизации дрожжевой ув галактозидазы на органоминеральных носителях и показана пригодность полученных нерастворимых препаратов для гидролиза лактозы при нейтральных значениях , наиболее подходящих для переработки продуктов из цельного молока. Определены характерные значения кинетических параметров процесса термоинактивации дрожжевой уЗ галактозидазы по диссоциативному механизму, необходимые при оптимизации технологического процесса с применением биокатализаторов. Апробация работы. Результаты работы доложены на ХУой Республиканской конференции молодых ученыххимиков ЭССР г. Уом Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии г. Киев, . Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научных статьи и тезисы двух докладов. Содержание и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы 3 . Работа представлена на 8 страницах машинописного текста, в т. Создание высокостабильных биокатализаторов одна из важнейших задач инженерной энзимологии. Стабилизация биологических макромолекул к различным денатурирующим воздействиям имеет важное практическое значение. Стабильность белка, т. Конформационные изменения играют важную роль в инактивации белков, так как они сопровождают, а часто запускают другие механизмы инактивации, которые были бы невозможны без предшествующих изменений структуры белка . Равновесная конформация, принимаемая данной макромолекулой, определяется ее первичной структурой, а также зависит от природы окружающей среды, температуры, и пр. Число различных конформаций, которые в принципе возможны для молекул белка, можно разделить , вопервых нативные, в которые он проявляет свою биологическую активность и, вовторых, остальные стереохимически возможные конформации, т. Фишером 8. Образование нативной глобулярной структуры, характерной для данного белка кооперативный процесс, основанный на различных типах нековалентных взаимодействий . Дисульфидные связи не определяют характер свертывания полипептидной цепи, но, несомненно, стабилизируют конформацию молекулы после завершения процесса свертывания, особенно в белках с четвертичной структурой . Это объясняет и низкую конформационную стабильность глобулярных белков, а также значительное уменьшение стабильности под влиянием небольших структурных изменений например, удаление концевой аминокислоты или расщепление одной пептидной связи. В нативном состоянии приблизительно часть глобулярного белка доступна для растворителя и является более полярной, чем скрытые полипептидные цепи 8. Следовательно, диссоциация, денатурация и другие конформационные изменения, которые увеличивают доступность полипептидных цепей растворителю, меняет полярность белковой молекулы, что влияет и на ее стабильность. Образование белков и их стабильность зависят от свободной энергии Гиббса системы, состоящей из белка и растворителя в данных физических условиях , 8. Процесс свертывания можно рассматривать как переход системы цепь плюс растворитель из состояния с более высокой свободной энергией случайная конформация в состояние с более низкой свободной энергией нативная конформация , , так как для нативной конформации гиббсовская свободная энергия минимальная при данных физических условиях.