Сравнительное исследование антимикробных белков нейтрофилов собаки и человека

• Автор: Берлов, Михаил Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 142 с.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Нейтрофил в защитных реакциях организма.

1.1.1. Пути активации нейтрофила

1.1.2. Гранулярный аппарат нейтрофилов.

1.1.3. Респираторный взрыв.

1.1.4. Миграция активированных нейтрофилов.

1.1.5. Фагоцитоз.

1.2. Кислородзависимые механизмы инактивации микробов нейтрофилами

1.2.1. Активные формы кислорода

1.2.2. МПОсистема.
1.3. Кислороднезависимые механизмы инактивации микробов нейтрофилами ф, 1.3.1. Катионные антимикробные пептиды
1.3.2. Лизоцим.
1.3.3. Серпроцидины
1.3.4. Лактоферрин.
1.4. Кооперативные взаимодействия антимикробных белков нейтрофилов
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Получение биологического материала.
2.1.1. Получение экссудата.
2.1.2. Получение кишечного сока
2.2. Выделение антимикробных белков из нейтрофилов экссудата собаки
2.2.1. Экстракция катионных белков из целых лейкоцитарных клеток
2.2.2. Ионообменная хроматография
2.2.3. Гельфильтрационная хроматография.
2.3. Электрофоретические методы.
2.3.1. Электрофорез в кислой буферной системе
2.3.2. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия.
2.4. Ссквенирование Йконцевого фрагмента белков
2.5. Определение молекулярной массы белков
Ь 2.6 Определение углеводного компонента в белках.
2.7. Сиектрофотометрические исследования
2.7.1. Определение степени чистоты миелоиероксидазы
2.7.2. Определение степени насыщения ЛФ железом
2.7.3. Установление спектров поглощения ЛФ и МПО в видимой области .
2.8. Изучение связывания ЛФ с железом.
2.8.1. Получение апоЛФ.
2.8.2. Получение холоЛФ
2.8.3. Диссоциация комплекса ЛФжелезо.
2.9. Определение активности ферментов.
2.9.1. Определение пероксидазной активности
2.9.2. Определение эстеразной активности эластазы
2.9.3. Определение эстеразной активности катепсина в.
2.9.4. Определение активности лизоцима.
2.9.5. Ингибиторный анализ.
2 Иммунохимические исследования.
21. Получение антисывороток к белкам.
22. Выделение из сыворотки фракции белков, обогащенной
иммуноглобулинами, методом высаливания
23. Иммуноаффинная хроматография
24. Конъюгация антител с пероксидазой хрена.
25. Твердофазный иммуноферментный анализ
2 Определение антимикробной активности белков.
2 Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Выделение антимикробных белков из нейтрофилов собаки.
3.2. Определение Ыконцевой аминокислотной последовательности белков
3.3. Физикохимические свойства белков
3.3.1. Молекулярная масса белков
3.3.2. Определение углеводного компонента в белках
3.3.3. Спектрофотометрическис исследования
3.3.4. Связывание ЛФ с железом
3.4. Энзимологические исследования
3.4.1. МПО
3.4.2. Эластаза и катепсин О
3.4.3. Лизоцим
3.5. Иммунохимические исследования
3.6. Изучение антимикробной активности белков.
3.6.1. Определение минимальной ингибирующей концентрации белков
3.6.2. Изучение кооперативных взаимодействий белков.
3.6.3. Изучение ферментативной активности белков в присутствии других белков
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Выделение антимикробных белков.
4.2. Свойства выделенных белков.
4.3. Иммунохимические исследования
4.4. Антимикробная активность белков
5. ВЫВОДЫ
6. Список литературы.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Позднее было показано, что активация происходит и в случае нейтрофилов . Интересно, что у насекомых активация рецепторов приводит непосредственно к синтезу и выделению во внутреннюю среду организма антимикробных веществ , . Хотя подобные результаты активации данного сигнального пути у млекопитающих прямо не показаны, известно, что промоторная область генов антимикробных пептидов из группы кателицидинов, а также некоторых . . Помимо прямого взаимодействия с нейтрофилами, могут влиять на нейтрофилы косвенным путем, связываясь с макрофагами, которые, в свою очередь, секретируют вещества, модулирующие активность нейтрофилов. Нейтрофилы также могут быть активированы факторами системы приобретенного иммунитета. Плазменные иммуноглобулины активируют фагоцитарную функцию нейтрофилов, выступая в качестве онсонинов п. . i . Л . Еще один способ активации нейтрофилов факторами системы приобретенного иммунитета синтез лимфоцитами цитокинов и других веществ, оказывающих влияние на нейтрофилы. Таким образом, пути активации нейтрофила в организме множественны и часто взаимосвязаны. Соответственно, нельзя говорить, что конкретный нейтрофил выполняет свою функцию исключительно в рамках системы врожденного или приобретенного иммунитета. Вдобавок, сами нейтрофилы секретируют биологически активные вещества, которые оказывают влияние на другие компоненты иммунной системы лимфоциты, макрофаги, комплемент. Некоторые примеры такого влияния рассмотрены в разделах 1. Одной из основных морфобиохимических особенностей нейтрофилов является наличие в клетках ранул, содержащих различные вещества, участвующие в умерщвлении фагоцитированного микроорганизма. Традиционная классификация гранул нейтрофилов основана на последовательности их появления в ходе миелопоэза и на присутствии или отсутствии фермента миелопероксидазы МПО. Согласно этой классификации, различают две основные популяции гранул первичные азурофильные содержат МПО и вторичные специфические не содержат МПО. Работы последних лет показали, что состав гранулярного аппарата более гетерогенсн , , . Гранулы нейтрофилов, не содержащие МПО, можно разделить на вторичные специфические и третичные желатиназные гранулы. Третичные гранулы не содержат лактоферрина, во вторичных по сравнению с третичными понижено содержание желатиназы. Содержимое гранул различных типов представлено в таблице 1. Вещества, обладающие антимикробной активностью, подробно рассмотрены в разделах 1. По всей видимости, не существует специального механизма индивидуальной сортировки белков в гранулы определенного типа, и все белки, синтезируемые в одно и то же время, оказываются в одних гранулах , , . Дегрануляция может быть индуцирована многими стимулами хемотаксическими факторами и хемокинами, доменами иммуноглобулинов, цитокинами. В стимуляции дегрануляции также могут участвовать рецепторы адгезии. При активации нейтрофила первыми мобилизуются третичные гранулы, затем вторичные и, в последнюю очередь, первичные азурофильные v . Дегрануляция является важным этапом двух процессов миграции нейтрофила в очаг воспаления п. В первом случае компоненты гранул выделяются во внеклеточную среду, во втором преимущественно в фагосомную вакуоль, хотя и с рядом оговорок Маянский А. Маянский Д. , . Вопервых, при фагоцитозе дегрануляция начинается параллельно с поглощением объекта фагоцитоза, и часть содержимого гранул, в первую очередь жслатиназных и специфических, попадает во внеклеточную среду. Некоторые функции, которые могут выполнять компоненты гранул внеклеточно, рассмотрены в разделах 1. Вовторых, при остром воспалении, а также если инфекционный агент не может быть поглощен фагоцитом изза своих размеров, вместо фагоцитоза происходит выброс в среду содержимого всех типов гранул, при этом секретированные белки и пептиды функционируют в первую очередь уже не как регуляторные молекулы, а в качестве микробоцидных веществ.