Выделение и характеристика сериновой протеиназы BACILLUS BREVIS, лизирующей клетки дрожжей CANDIDA UTILIS

• Автор: Калебина, Татьяна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 176 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ. II

1. М0РФОЛИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЕЙ

2. СТРОЕНИЕ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ

СТЕНКИ ДРОЖЕЙ

2.1. Глюкая.

2.2. Манная
2.3. Хитин
2.4. Белок
3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ЛИЗИС КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
ДРОЖЕЙ
3.1. Глюканазы
3.2. Маннаназы
3.3. Протеиназы.
3.4. Хитивазы
3.5. Липазы.
4. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
ДРОЖЕЙ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.
I. КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И УСЛОВИЯ ИХ
ВЫРАЩИВАНИЯ.
2. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ДРОЖЖЕЙ
3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
3.1. Хроматография культуральной жидкости вас.vi штамм 54 на аффинных сорбентах бацитрацин аминосилохром и фенилборонатсефароза
3.2. Хроматографи сериновой протеиназы Вас.vi
штамм 54 на сефадексе
4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ АКТИВНОСТЕЙ .
4.1. Протеолитическая активность .
4.2. Дрожжелитическая активность .
4.3. Глшсозидазные активности.
5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
5.1. Определение белка
5.2. Определение редуцирующих сахаров
5.3. Определение общего количества белка в
клеточных стенках дрожжей
5.4. Определение общего количества углеводов в клеточных стенках дрожжей.
6. ИЭЛЕКГР0Ф0КУСИР0ВАНИЕ.
7. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
7.1. Электрофорез в полиакриламидном геле без додецилсульфата .
7.2. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата .
8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ПРОТЕИНАЗЫ
ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В ас. vi ШТАММ 54 .
8.1. Кислотный гидролиз белка.
8.2. Определение полуцистина и метионина
8.3. Оцределение триптофана
8.4. Аминокислотный анализ белка.
9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ВАС.VI ШТАММ 54
9.1. Предварительная денатурация белка фенолом .
9.2. Автоматический анализ аминокислотной последовательности белка.
. ЗОНАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ
С .II в ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ
. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ
С.II
. ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ С .II ПРИМУЛИНОМ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. ВЫБОР МИКРООРГАНИЗМА АКТИВНОГО ПРОДУЦЕНТА ДРОЖЖЕЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
2. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ДРОЖЖЕЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ВАС .VI
ШТАММ 54
3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА СЕРИНОВОЙ ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ВАС. VI
ШТАММ 54
Краткий обзор литературы
Полученные результаты .
3.1. Выделение протеиназы
3.2. Определение аминокислотного состава секретируемой протеиназы вас.vi штамм 54 .
3.3. Определение концевой последовательности секретируемой протеиназы Вас.vi
штамм 54
3.4. Оцределение молекулярного веса секретируемой протеиназы Вас.vi штамм 54 .
3.5. Определение субстратной специфичности секретируемой протеиназы вас.vi штамм 54
3.6. Ингибиторный анализ
3.7. Влияние температуры среды инкубации на дрожжелитическую и протеолитическую активности протеиназы
3.8. Влияние среды инкубации на дрожжелитическую и протеолитическую активности протеиназы.
4. ЛИТШЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОТЕИНАЗЫ ВАС .VI
НА ЖИВЫЕ КЛЕТКИ ДРОКЕЕЙ С .II
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ .
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На основании полученных результатов, а также сведений, опубликованных в литературе, предложена схема возможных изменений, происходящих в клеточной стенке дрожжей в процессе роста культуры. I. МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ. Электронномикроскопическое изучение клеточной стенки дрожжей дало исследователям основные цредставления о ее морфологии. Согласно современным взглядам клеточная стенка дрожжей состоит из микрокристаллического структурного компонента, представленного в основном фибриллами вглюкана и аморфного матрикса маннопротеиновой природы толщина ее колеблется в пределах А0 ,5. Клеточная стенка дрожжей имеет слоистое строение. В большинстве случаев число слоев равно трем, однако, в зависимости от стадии роста, условий выращивания и способа фиксации, вида и даже штамма дрожжей оно может колебаться в широких пределах 6,6. Подобная морфологическая гетерогенность клеточной стенки дрожжей, наблюдаемая при электронномикроскопических исследованиях, в первую очередь, обусловлена ее химической неоднородностью. На электронных микрофотографиях клеточной стенки дрожжей отчетливо видно наличие двух электронноплотных слоев, наружный из которых представлен маннопротеинами, а также менее плотного промежуточного слоя, который содержит глгокан. Внутренний слой, возможно, включает в себя белкиферменты, его иногда отождествляют с периплазмой ,0,1. Непосредственно к этому слою примыкает плазмалемма. Иногда на поверхности клеток обнаруживается еще один слой рыхлого, неструктурированного материала полисахаридная капсула 3. Интересными структурами,. Они отличаются от остальной поверхности клеточной стенки главным образом высоким содержанием хитина. Этот полимер участвует в построении первичной перегородки септы между материнской и дочерней клетками ,. Таким образом основными компонентами клеточной стенки дрожжей являются глюкан и маннан, находящиеся в тесной ассоциации с белком структурный маннопротеин. Судя по результатам электронномикроскопических исследований эти компоненты, располагаясь слоями, образуют плотную, ригидную оболочку дрожжевой клетки ее наружный скелет. В состав клеточной стенки дрожжей входит, также, хитин. Изучению химического состава и строения глюкана, маннопротеинового комплекса и хитина посвящено много работ. Выполненные с помощью сочетания разнообразных физикохимических, энзиматических и электронномикроскопических методов эти исследования позволили определить не только химическое строение этих компонентов, но и частично изучить ультраструктуру самой клеточной стенки. Без подробного ознакомления с результатами этих исследований невозможно создать полную картину современных представлений о том, как устроена и функционирует эта клеточная органелла. В этой связи следующая глава обзора литературы посвящена вопросам строения основных компонентов клеточной стенки дрожжей. Как уже отмечалось ранее, основными компонентами клеточной стенки дрожжей являются, прежде всего, структурные полисахариды глюкан и манная, строение и количественное соотношение которых сильно варьирует в зависимости от вида дрожжей. Маннан находится в тесной ассоциации с белком, что позволяет говорить о маннопротеиновом комплексе, составляющем основу аморфного матрикса клеточной стенки дрожжей. Следует отметить, однако, что структура белкового компонента этого комплекса специально до сих пор не изучалась. В клеточной стенке содержится, также, незначительное количество хитина, липидов и фосфорсодержащих соединений ,,6. В количественном отношении клеточная стенка дрожжей составляет приблизительно Для выделения и очистки индивидуальных компонентов клеточной стенки дрожжей с целью дальнейшего их изучения обычно используют процедуры, включающие последовательную обработку клеточной стенки щелочью, кислотой, а также гидролитическими ферментами 1,3, 9 рис. В таблице I представлен химический состав клеточной стенки двух видов дрожжей, размножающихся почкованием и наиболее часто используемых в практике лабораторных исследований. Ыаон при С 6 час. В. Рисунок I. Схема выделения структурных компонентов клеточной стенки дрожжей.