Молекулярно-биологические аспекты создания укороченных форм цитохрома Р450 2В4

• Автор: Прозоровский, Тимур Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕб

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

2.1. Функция цитохромов Р0

2.2. Суперсемейство цитохромов Р0.

2.3. Подгруппа цитохромов Р0 2В.

2.4. Реакционный механизм и структура цитохром 40содержащих систем

2.5. Структурнофункциональное взаимодействие

цитохромов Р0

2.6. Мембранная топология цитохромов Р0.

2.6.1. Роль концевого района эукариотических цитохромов РС
2.6.2. Предсказание топологии на основании
первичной структуры.
2.6.3. Электронно микроскопический анализ.
2.6.4. Субклеточная локализаций цитохромов Р0 2В4 .
2.6.5. Доступность Мконцевых районов цитохромов Р0 для протеолитического расщепления
2.7. Методика получения водорастворимых форм Р0.
2.8. Получение эукариотрческих Р0 в ii
2.8.1. Транскрипция.
2.8.2. Трансляция.
2.8.3. Экспрессия белка.
2.8.4. Очистка рекомбинантного белка
2.9. Молекулярные шапероны и белковый фолдинг.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Моделирование мутанатных форм цитохрома Р0 2В4.
3.2. Генетические методы
3.2.1. Полимеразная Цепная Реакция.
3.2.2. Рестрикция эндонуклеазами.
3.2.3. Электрофорез в агарозном геле.
3.2.4. Лигирование фрагментов ДНК
3.2.5. Трансформация клеточных линий .i
3.2.6. Разращивание клеток.
3.2.7. Выделение плазмидной ДКК
3.2.8. Рестрикционный анализ.
3.2.9. Создание плазмидных конструкций.
3.3. Микробиоллогические методы
3.3.1. Микроорганизмы
3.3.2. Культуральные среды.
3.4. Препаративные методы
3.4.1. Экспрессия белка
3.4.3. Выделение цитозольной фракции.
3.4.4. Очистка полноразмерного и химерных форм цитохромов Р4 2В4
3.4.5. Ограниченный лротеолиз с фактором Ха, тромбином и 1дА энлопротеиназой.
3.5. Аналитические методы.
3.5.1. Определение концентрации рекомбинантного гемопротеина
3.5.2. Электрофоретическое разделение белков в
3.5.3. Иммуноблоттинг
3.5.4. Определение Ыкокцевой аминокислотной последовательности
3.5.5. Определение олигомерного состояния
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Выбор района для создания протеолитических сайтов
4.2. Плазмидные конструкции
4.3. Экспрессия мутантных форм цитохрома Р0 2В4
4.4. Ассоциация химерной конструкции цитохрома
Р0 2В4 с высокомолекулярными белками
4.5. Иммунодетекция
4.6. Анализ Ыконцевых аминокислотных последовательностей
4.7. РРСРХРХРХХС мотив микросомальных цитохромов Р0
4.8. Диссоциация комплекса.
4.9. Гельфильтрация цитохрома Р0 2В4, лишенного
Ыконцевых аминокислотных остатка
4 Изучение влияния Ыконцевой аминокислотной
последовательности 2В4 на ассоциацию с шаперонами
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Являясь компонентами монооксигеназных систем, они вовлечены в метаболизм широкого спектра эндогенных и экзогенных веществ . . . У млекопитающих Р0 ответственны за окисление лекарств, лрокарциногенов, токсичных веществ, а также биосинтез стероидов и эйкозанойдов i . . . Одной из отличительных особенностей изолированных микросомальных цитохромов Р0 является их высокий уровень самоагрегации в растворе в отсутствии детергента, что приводит к потери активности. Использование липидов или детергентов восстанавливает ферментативную активностью, однако, присутствие молекул детергентов или липидов осложняет изучение каталитической активности и механизма белокбелковых взаимодействий в монооксигеназных системах . . . Р0 в кристаллической форме, является создание генетической конструкции, позволяющей экспрессировать водорастворимую форму белка. В последние годы огромные усилия в изучении цитохромов Р0 были направлены на гетерологическую экспрессию Р0 млекопитающих в бактериальных клетках, клетках насекомых, бакуловирусе и дрожжах Сиi . i . . . v . . . . . . Основной стратегией для получения мономерных форм микросомальных Р0 является экспрессия укороченных вариантов Р0, лишенных гидрофобного концевого сигнального района, служащего якорной частью цитохрома в мембране . . . . . . . концевого района при ограниченном протеолизе в генетически сконструированном сайте . . Бтрансферазой нашло широкое применение i . . . Данная система увеличивает растворимость отдельных белков и способствует повышению уровня экспрессии белка. Уже на первых этапах работы, было обнаружено, что экспрессируемые химерные молекулы находятся в комплексе с другими высокомолекулярными белками. Целью данной работы являлось разработка генетических и молекулярнобиологических подходов для получения укороченных форм цитохрома Создание укороченных форм цитохрома 40 2В4. Создание с помощью генетической инженерии конструкций Р0 2В4 в виде химерного белка с глутатионЗтрансферазой, позволяющих осуществить удаление гидрофобного концевого сегмента 1 после гетерологической экспрессии в . Исследование доступности протеолитического сайта, узнаваемого фактором Ха в конструкции 22В4Ха для ограниченного протеолиза. Введение дополнительных глициновых остатков по обе стороны протеолитического сайта узнавания фактором Ха для создания района более доступного для действия протеиназы. Введение тромбинового сайта в позицию цитохрома Р0 4 и проведение анализа ограниченного протеолиза. Анализ ограниченного протеолиза с 1дА эндопротеиназой, узнающей пролиновый мотив РР6Р в цитохроме Р0 2В4. Анализ олигомерного состояния укороченной формы цитохрома Р0. Исследование влияния Мконцевой последовательности Р0 2В4 на ассоциацию с молекулярными шаперонами. Замена Ыконцевых аминокислотных остатка цитохрсма Р0 Д22В4 на соответствующих остатков цитохрома Р0 АЗ2Е1. Исследование взаимодействия химерного белка ГБТ2Е12В4 и полноразмерной формы цитохрома Р4 2В4 с клеточными шаперонами. Экспериментальная часть настоящей работы выполнялась в ЫахСе1ЬгискСепЬгиш Берлин, Германия, лаборатория Р0 и эндоплазматический ретикулум. Методическая подготовка и освоение методов связанных с генетической инженерией и молекулярнобиологической работой на примере создания мутантных форм гидроксистероид дегидрогеназ проходили в КагоИПэка Тпзблбибеб Стокгольм, Швеция, Департамент Химии. Цитохромы Р0 образуют обширное суперсемейство ферментов, которые з составе Р0зависимой монсоксигеназкой системы ЕС 1. . . . . . . Разнообразие этих оксидаз и их потенциал для индустриальных целей представляет огромный интерес в понимании их структуры, функции и окислительновосстановительных реакций. Р0 обладают существенными различиями в субстратспецифичности и стереоселективности. . . . ..