Взаимодействие олигонуклеотидов со структурированными участками РНК

• Автор: Петюк, Владислав Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 181 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
1 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ РНК НА ТЕРМОДИНАМИКУ И КИНЕТИКУ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 ВЕДЕНИЕ

1.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С РНК

1.3 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ РНК НА СРОДСТВО ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

1.3.1 Взаимодействие олигонуклеотидов с тРНК.2

1.4 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ РНК НА КИНЕТИКУ ГИБРИДИЗАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

1.5 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К РАСЧЕТУ СРОДСТВА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ К СТРУКТУРИРОВАННЫМ УЧАСТКАМ РНК.4
1.6 СРАВНЕНИЕ АКТИЗНОСТИ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ И КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК I VI С ТЕОРЕТИЧЕСКИ РАССЧИТАННЫМИ ПАРАМЕТРАМИ СРОДСТВА К РНКМИШЕНЯМ
2 ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ, КИНЕТИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ СО СТРУКТУРИРОВАННЫМИ РНК

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ГИБРИДИЗАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ДРОЖЖЕВОЙ .
2.1.1 Выбор модели, дизайн олигонуклетидов .
2.1.2 Равновесная гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой
2.1.2.1 Влияние структуры сайта комплементации на эффективность связывания олигонуклеотидов с тРНК
2.1.2.2 Определение равновесных констант связывания олигонуклеотидов с дрожжевой .
2.1.2.3 Анализ гибридизации олигонуклеотидов 1А и 1 с тРНК с помощью РНКазы Н
2.1.2.4 Статистический анализ кривых равновесного связывания олигонуклеотидов
2.1.2.5 Влияние температуры и ионов магния на равновесное связывание олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК
2.1.2.6 Гибридизация олигонуклеотидов с тРНКЬе обсуждение результатов .
2.1.3 Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе
2.1.3.1 Влияние сайта комплементации на скорость гибридизации
олигонуклеотида с дрожжевой тРНК
2.1.3.2 Влияние минорных оснований, температуры и ионов магния на кинетику гибридизации олигонуклеотидов с тРНК . .
2.1.3.3 Обсуждение данных по скорости гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРИе
2.1.4 Природа влияния ионов магния на гибридизацию олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе
2.1.4.1 Зависимость степени равновесного связывания олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе от концентрации ионов магния
2.1.4.2 Влияние ионов магния на стабильность комплекса тРНКЮ .
2.1.5 Механизм гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКрЬе
2.1.5.1 Анализ зависимости скорости гибридизации от концентрации олигонуклеотида
2.1.5.2 Пробинг структуры тРНК в процессе гибридизации с олигонуклеотидом .
2.1.5.3 Анализ динамики изменений структуры тРНК в процессе гибридизации олигонуклеотида.
2.1.6 Гибридизация аналогов олигонуклеотидов, несущих модифицированные основания, с дрожжевой тРНКРЬе
2.1.6.1 Дизайн олигонуклеотидов
2.1.6.2 Влияние участка комплементациина эффективность гибридизация аналогов олигонуклеотидов, несущих модифицированные основания, с дрожжевой тРНКРИе.
2.1.6.3 Определение минимального размера олигонуклеотида, способного связываться с тРНК
2.2 ГИБРИДИЗАЦИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С 1ЗВЕННЫМ ФРАГМЕНТОМ рРНК II СОЫ, СОДЕРЖАЩЕМ аСАРЦИНОВУЮ ПЕТЛЮ
2.2.1 Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов
2.2.2 Гибридизация олигонуклеотидов с 1 РНК
2.2.2.1 Влияние сайта комплементации олигонуклеотида на эффективность гибридизации с РНКмишенью
2.2.2. 2 Определение равновесных константы гибридизации
2.2.2.3 Определение сайтов связывания олигонуклеотидов с 1 РНК с помощью гидролиза РНКазой Н
2.2.2. 4 Обсуждение гибридизации олигонуклеотидов с фрагментом 1 РНК.
2.2.3 Влияние ионов магния на гибридизацию олигонуклеотидов
с 1 РНК
2.2.4 Определение параметров ЕА, АН, процесса гибридизации олигонуклеотида 5 с 1 РНК. Механизм гибридизации
2.2.4.1 Температурная зависимость константы скорости гибридизации олигонуклеотида 5 с 1 РНК. Определение энергии активации ЕА
2.2.4.2 Температурная зависимость равновесной константы связывания олигонуклеотида 5 с 1 РНК определение АН,
2.2.4.3 Анализ параметров гибридизации 5. Механизме процесса гибридиз а ции
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 МАТЕРИАЛЫ
3.2 МЕТОДЫ.
3.2.1 Получение i vi транскрипта дрожжевой тРНКРЬе
3.2.2 Введение Рметки по ЗОН группе тРНК
3.2.3 Введение Рметки в 5концевое положение тРНК.,.
3.2.4 Измерение зависимости равновесной степени связывания
от концентрации олигонуклеотидов
3.2.5 Измерение зависимости степени связывания от времени
инкубации.
3.2.6 Вытеснение олигонуклеотида 1 из комплекса
под действием ионов магния
3.2.7 Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях .
3.2.8 Футпринт комплексов олигонуклеотидтРНК с помощью
РНКазы Н .
3.2.9 Анализ изменений структуры тРНКРЬе в ходе гибридизации
с олигонуклеотидом 1.
3.2. Идентификация минимальной длинны олигонуклеотидов,
способных связываться с тРНК
3.2. Получение пиреновых производных олигонуклеотидов
3.2. Приготовление 1 РНК транскрипта
3.2. Определение последовательности фрагмента 1 .
3.2. Введение Рметки по 5концу 1 РНК
транскрипта.
3.2. Пробинг вторичной структуры 1 НКтранскрипта
3.2. Анализ сайтов гибридизации олигонуклеотидов с
РНКтранскриптом при помощи РНКазы Н
3.2. Гибридизация олигонуклеотидов с 1 РНК
транскриптом .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


РНК мишень инкубируют с реакционноспособным производным олигонуклеотида, в комплексе олигонуклеотидРНК происходит ковалентная сшивка молекул вследствие реакции алкилирования. Полученный в результате реакции продукт отделяют от не прореагировавшего олигонуклеотида и РНК с помощью гельэлектрофореза в денатурирующих условиях. Зависимость предельных по времени значений степени модификации РНК от концентрации реакционноспособного производного олигонуклеотида позволяет рассчитать равновесную константу гибридизации. Данный метод предполагает использование радиоактивно меченых или РНКмишени, или производного олигонуклеотида. РНК мишенью. По своему исполнению этот метод похож на метод гибридизации на фильтрах радиоактивно меченная РНК инкубируется с олигонуклеотидным микрочипом, затем, после отмывки несвязавшейся РНК, по интенсивности радиоактивности определяют эффективность гибридизации того или иного олигонуклеотида. Этот метод, за счет возможности одновременного анализа широкого массива олигонуклеотидов, очезидно, получит широкое применение в ближайшее время. Возможно использование флуоресцентно меченной РНК и одновременный анализ кривых термической денатурации комплексов олигонуклеотидРНК. Следует отметить, что при гибридизации на микрочипах некоторые искажения в эффективность связывания РНК с олигонуклеотидами могут быть внесены за счет гетерофазности системы взаимодействующих компанентов, в частности, за счет стерических факторов, связанных с ориентацией олигонуклеотида относительно матрицы . РНКмишенью проводят либо разделение свободных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, связавшихся с РНК, с помощью гельэлектрофореза , либо идентификацию сайтов связывания олигонуклеотидов путем расщепления РНК в комплексе с олигонуклеотидами с помощью РНКазы Н , . РНК. ДНК или РНК с некоторым распределением длин олигонуклеотидов , . Например, в работе , фракцию суммарной тРНК Е. РНКазой Н. Затем, тестировали акцепторную активность тРНК. Зависимость уровня акцепторной активности от концентрации олигонуклеотида позволяла косвенно судить об эффективности связывания олигонуклеотида, а значение концентрации, при которой на ингибировалась акцепторная активность, соответствовала обратной величине константы связывания. Преимуществами метода равновесного диализа, флуоресцентных подходов и сайтнаправленной модификации является отсутствие внешних воздействий, способных исказить данные. В случае подходов с использованием иммобилизованных компонентов методы гибридизации на фильтрах и микрочипах, некоторые искажения могут вносится за счет гетерофазной природы процесса. Значительным недостатком вышеуказанных подходов является необходимость, для количественного анализа процесса гибридизации, строгого описания механизма взаимодействия, в частности, полноты связывания и стехиометрии связывания олигонуклеотидов с молекулой РНКмишени. С нашей точки зрения, метод задержки в геле является одним из наиболее гибких и информативных подходов среди существующих экспериментальных методов исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК. Взаимодействие олигонуклеотидов с природными РНК в значительной степени отличаются от гибридизации с синтетическими неструктурированными олигонуклеотидами , 7. РНК предполагает, что часть сайтов связывания вовлечена во внутримолекулярные взаимодействия и недоступна для непосредственного формирования УотсонКриковских пар. Сложность пространственной структуры природных РНК требует учета большого количества параметров, необходимых для точкой оценки эффективности гибридизации олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам РНК. В данном разделе будут рассмотрены работы, в которых было исследовано влияние структуры модельных РНК на их гибридизацию с олигонуклеотидами. Влияние структуры шпилек РНК на гибридизацию с комплементарными олигонуклеотидами изучали в работах , . На мРНК, позволило авторам детально проанализировать влияние структуры РНК на процесс гибридизации олигонуклеотидов рис. Рис. На мРНК и комплементарные к ней олигонуклеотиды .