Множественно-модифицированные липопротеиды низкой плотности, циркулирующие в крови человека

• Автор: Тертов, Владимир Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 333 с.

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. ОБНАРУЖЕНИЕ И ВЫДЕЛЕНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛНП цмЛНП.

1.1. Обнаружение циркулирующих атерогенных ЛНП

1.2. Разработка метода выделения цмЛНП

1.3. Определение уровня цмЛНП в крови человека

1.4. Обсуждение результатов.

Глава 2. ВЛИЯНИЕ цмЛНП НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ И СИНТЕЗ КОМПОНЕНТОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННОГО МАТРИКСА

КУЛЬТИВИРУЕМЫМИ КЛЕТКАМИ ИНТИМЫ АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА

Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАТИВНЫХ ЛНП И цмЛНП.

3.1. Химический состав.

3.1.1. Углеводный состав
3.1.2. Липидный состав
3.1.3. Обсуждение результатов.
3.2. Физические параметры.
3.2.1. Размер частиц
3.2.2. Плотность
3.2.3. Заряд
3.2.4. Обсуждение результатов.
3.3. Анализ аполипопротеида В.
3.3.1. Свободные аминогруппы лизиновых остатков.
3.3.2. Устойчивость к протеолизу
3.3. Обсуждение результатов
3.4. Степень окисленности и окисляеыость липопротеидов.
3.4.1. Содержание гидроперекисей и ТБКреактивных продуктов в нативных ЛНП и цмЛНП
3.4.2. Разработка метода определения аддуктов липидов с апоВ маркеров окисления ЛНП i viv.
3.4.3. Степень i viv окисленности нативных ЛНП и цмЛНП
3.4.4. I vi окисляемость нативных ЛНП и цмЛНП.
3.4.5. Содержание жирорастворимых антиоксидантов в нативных ЛНП
и цмЛНП
3.4.6. Взаимосвязь между уровнем антиоксидантов в ЛНП и их степенью i viv окисленности и i vi окисляемостью.
3.4.7. Взаимосвязь между степенью окисленности ЛНП и
их атерогенностью
3.4.8. Обсуждение результатов.
3.5. Взаимосвязь между выраженностью различных модификаций ЛНП и
атерогенностью липопротеидов
Глава 4. ЦмЛНП И ДРУГИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЛНП, ОБНАРУЖЕННЫЕ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.
4.1. Содержание сиаловой кислоты в электроотрицательных и аортальных ЛНП
4.2. Обсуждение результатов.
4.3. Сравнение свойств обнаруженных i viv модифицированных ЛНП
Глава 5. МНОЖЕСТВЕННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЛНП В ПЛАЗМЕ КРОВИ.
5.1. Десиалирование ЛНП
5.2. Изменение липидного состава.
5.3. Изменение физических параметров.
5.4. Перекисное окисление липидов и деградация апоВ
5.5. Появление атерогенного потенциала.
5.6. Обсуждение результатов
Глава 6. МЕТАБОЛИЗМ цмЛНП В ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ ИНТИМЫ АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА.
6.1. Захват ЛНП
6.2. Взаимодействие ЛНП с компонентами клеточных мембран
6.3. Интернализация ЛНП
6.4. Внутриклеточная деградация аполипопротеида В
6.5. Метаболизм липидов липопротеидов
6.6. Обсуждение результатов.
Глава 7. МЕХАНИЗМЫ УСИЛЕНИЯ АТЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА цмЛНП.
7.1. Агрегация модифицированных ЛНП
7.2. Образование циркулирующих иммунных комплексов.
7.3. Формирование комплексов ЛНП с компонентами соединительнотканного матрикса.
7.4. Обсуждение результатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Выделение и фракционирование ЛНП
2. Культура клеток.
3. Аналитические методы СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ААПГ 2,2азобис2аминопропан гидрохлорид
АпоВ аполиполротеин В
БСА бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ выскоэффективная жидкостная хроматография
ИФБ изотонический фосфатный буфер
ЛВП липопротеиды высокой плотности
ЛНП липопротеиды низхой плотности
ЛОНП липопротеиды очень низкой плотности
ЛПП липопротеиды промежуточной плотности
МДАЛНП ЛНП, модифицированные малоновым диальдегидом
ПААГ полиакриламидный гель
РАБ рецепторассоциированный белок
РКА,зо аглютинин ii i
ТБК тиобарбитуровая кислота
ТХУ трихлоруксусная кислота
ЦИК циркулирующие иммунные комплексы
ЦИКЛНП ЛНП, выделенные из циркулирующих иммунных комплексов ЦмЛНП циркулирующие модифицированные ЛНП ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ЯМР ядерный магнитный резонанс
ВВЕДЕНИЕ


Для определения уровня цмЛНП в плазме крови человека мы разработали твердофазный лектиниммуноферментный метод, основанный на связывании модифицированных липопротеидов с РКА,, иммобилизованным в лунках планшет, с последующим их выявлением с помощью пероксидазамеченых антиапоВ поликлональных антител. На рисунке 5 приведены данные по подбору оптимальных концентраций РКА, для покрытия лунок. Можно видеть, что в диапазоне концентраций мкгмл количество связываемых обработанных нейраминидазой десиалированных ЛНП одинаково. Поэтому в дальнейших экспериментах была использована концентрация мкгмл. Для определения оптимальной концентрации антител против апоВ были использованы 5 разведений. Как следует из рисунка 6. В не изменялось в интервале концентраций 5 мкгмл. Концентрация антител мкгмл была выбрана для использования в последующих экспериментах. На рисунке 7 приведена типичная кривая титрования обработанных нейраминидазой ЛНП. В антител. Рис. Концентрационная зависимость для покрывающего раствора РКА,. Рис. Концентрационная зависимость для антиалоВ поликлональных антител. Рис. Калибровочная кривая для ЛНП, обработанных нейраминидазой. Рис. Калибровочные кривые для нативных ЛНП о, цмЛНП и ЛНП, обработанных нейраминидазой . На рисунке 8 приведены концентрационные кривые для обработанных нейраминидазой ЛНП и цмЛНП. Можно видеть, что концентрационные кривые как для i viv, так и для i vi десиалированных лилопротеидов практически совпадают. Из приведенных данных следует, что десиалированные липопротеиды могут быть измерены в интервале концентраций 0 нгмл. При этом, выделенные с помощью лектинхроматографии нативные ЛНП практически не связываются с РКА вплоть до концентраций 1 мгмл. Для определения специфичности метода образцы десиалированных ЛНП были обработаны галактоэидазой, ках описано i . Эта процедура удаляла более галактозы липолротеидов. При этом обработанные галактозидазой ЛНП не связывались с иммобилизованным пектином и, соответственно, не выявлялись антителами. На рисунке 9 приведены кривые титрования сыворотки крови здорового донора и пациента с коронарным атеросклерозом, а также в препаратах ЛНП. Совпадение кривых позволяет сделать заключение, что в интервале концентраций 0 нгмл другие компоненты сыворотки не влияют на определение десиалированных ЛНП. На рисунке приведена корреляционная зависимость между концентрацией цмЛНП в сыворотках здоровых лиц и пациентов, а также в препаратах ЛНП, выделенных из крови тех же доноров Коэффициент корреляции составил 0, р0,1. Рис. Определение цмЛНП здоровых лиц 1. ЛНП 2, 3. Рис. Корреляция между количеством цмЛНП, определенном в цельной сыворотке, и количеством цмЛНП, измеренном в выделенном препарате суммарных липопротеидов. Рис . Корреляция между уровнями цмЛНП, определенными твердофазным лектиниммуноферментным методом лектинИФМ и с помощью колоночной хроматофафии. В в препаратах десиалированных ЛНП, полученных с помощью колоночной лектинхроматографии на РКА0. Можно видеть что наблюдается тесная корреляция между содержанием десиалированных ЛНП, определенных двумя методами коэффициент корреляции 0,, р0,5. Чувствительность метода составляет 5 нг цмЛНП на мл пробы. Измерение уровня цмЛНП в крови ти здоровых доноров показало, что их содержание варьирует от до 5 мкгмл 1,4,7 от общего уровня апоВ в сыворотке. Средняя концентрация составила мкгмл 7,,7 от уровня апоВ. Уровень цмЛНП в крови ти пациентов с коронарным атеросклерозом составлял от 3 мкгмл ,0 от уровня апоВ в сыворотке до 4 мкгмл ,5 в среднем 2 мкгмл или ,,3. Различие средних уровней содержания десиалированных ЛНП в крови здоровых лиц и пациентов было статистически значимым рО,. Обсуждение результатов. Таким образом, в настоящей работе показано, что подфракция цмЛНП, выделенных из крови больных ИБС, обладает способностью вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках интимы аорты человека. По всей видимости, цмЛНП определяют атерогенные свойства всей фракции ЛНП пациентов с коронарным атеросклерозом. В ЛНП здоровых лиц также имеются десиалированные липопротеиды, однако, они вызывают аккумуляцию внутриклеточного холестерина в меньшей степени по сравнению с десиалированными ЛНП из крови больных.