Механизм подавления агрегации белков α-кристаллином

• Автор: Ханова, Елена Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 182 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор штературы.

1.1. Агрегация белков.

1.2. Общая характеристика белков теплового шока .

1.3. Малые белки теплового шока

1.4. аКристаллин структура, свойства и шапероноподобная функция

1.4.1. Сравнение структуры акристаллина и малых белков теплового шока

1.4.2. Олигомерная структура акристаллина

1.4.3. Стабильность акристаллина.

1.4.4. Шапероноподобная активность акристаллина. Подавление агрегации белков акристаллицом.

1.5. Кристаллин хрусталика глаза быка структура, термостабилыюсть.

1.5.1. Влияние УФоблучения на структуру и агрегацию кристаллина
1.6. ГлицсральдегидЗфосфатдегидрогеназа из мышц кролика структура, термостабилность.
1.7. Транскстолаза из vii структура,
тсрмостабильность.
1.8. Алкогольдегидрогеназа I из vii структура, термостабшщность
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.1.1. Выделение и очистка а и крисгаллинов
2.1.2. ГлицеральегидЗфосфатдсгидрогсназа.
2.1.3. Транскетолаза из vii
2.1.4. Очистка акогольдегидрогеназы I из vii
2.1.5. Рекомбинантный шаперон .
2.2. Методы ,
2.2.1. Электрофоретический анализ в ПААГ
2.2.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия ДСК
2.2.3. Динамическое лазерное светорассеяние ДЛС.
2.2.4. Изучение кинетики тепловой агрегации и ассоциации белков методом
2.2.5. Аналитическое ультрацентрифугирование
2.2.6. Определение активности глицеральдегид3фосфатдегидрогеназы.
2.2.7. Термоинактивация глицеральдегид3фосфатдегидрогсназы.
2.2.8. Определение активности алкогольдегидрогеназы I из vii.
2.2.9. УФоблучение кристаллина.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Исследование стабильности акристаллина в процессе нагревания.
3.2. Тепловая денатурация и агрегация ркристаллина.
3.2.1. Электрофорез препарата кристаллина в ПААГ.
3.2.2. Седиментациоиный анализ препарата Рькристаллина.
3.2.3. Тепловая денатурация Рькристалина в отсутствие и в присутствии акристаллина
3.2.4. Кинетика тепловой агрегации рькристаллина
3.2.5. Влияние акристаллина на кинетику агрегации рькристаллииа.
3.2.6. Агрегация УФоблученного рькристаллина. Влияние акристаллина.
3.3. Тепловая денатурация и агрегация глицсральдегид3фосфатдегидрогеназы ГАФД
3.3.1. Тепловая денатурация ГАФД
3.3.2. Седиментациоиный анализ ГАФД.
3.3.3. Исследование кинетики агрегации ГАФД при различных температурах
3.3.4. Зависимость кинетики агрегации ГАФД от концентрации белка при С
3.3.5. Корреляция между тепловой агрегацией и инактивацией ГАФД.
3.3.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией ГАФД.
3.3.7. Влияние акристаллина на тепловую денатурацию ГАФД.
3.3.8. Седиментациоиный анализ ГАФД в присутствии акристаллина.
3.3.9. Влияния акристаллина на процесс тепловой инактивации ГАФД.
3.3 Влияние акристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД при и
3.3 Влияние акристаллина на тепловую агрегацию ГАФД при нагревании с
постоянной скоростью.
3.3. Влияние на кинетику тепловой агрегации ГАФД при С.
3.4. Тепловая агрегация транскетолазы из vii
3.4.1. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при нагревании с постоянной скоростью.
3.4.2. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при постоянной температуре
3.5. Тепловая денатурация и агрегация алкогольдегидрогеназы I из vii
3.5.1. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы
3.5.2. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы в присутствии акристаллина .
3.5.3. Кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы
3.5.4. Влияние акристаллина на кинетику агрегации
алкогольдегидрогеназы.
3.5.5. Влияние акристаллина на тепловую агрегацию АДГ I в режиме нагревания с постоянной скоростью
3.5.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией АДГ 1.
3.5.7. Моделирование трехмерной структуры АДГ I из
vii.
Заключение
Выводы.
Список литературы


Вариабельный терминальный домен обеспечивает образование высокомолекулярных олигомеров v . Все малые белки теплового шока образуют динамичные олигомерные структуры кДа, содержащие от 9и до и субъединиц и большей частью не обладают определенной четвертичной структуры. Олигомеризация является необходимым условием для функционирования , i, i Vii, . Общим свойством большей части , включая акристаллин, является их способность к образованию растворимых комплексов с денатурированными белками и предотвращение преципитации белков. Эго свойство названо шапероноподобной активностью. Берзелиусом в г. Кристаллины разделяют на три класса а, и у. Кристаллин, являясь представителем семейства малых белков теплового шока, обладает шапероноподобной активностью i, v, . В хрусталике глаза акристаллин, благодаря шапероноподобной активности, предотвращает агрегацию и укристаллинов , . Уменьшение шапероноподобной активности акристгаллина может сопровождаться агрегацией и укристаллинов и развитием катаракты . Кристаллин состоит из двух типов субъединиц, аА и аВ, с молекулярной массой кДа, содержащих гомологичных аминокислотных остатков, что составляет почти ную гомологию V . А и аВкристаллины являются продуктами двух генов аА и аВ i, . Соотношение аА и аВ субъединиц в составе акристаллина обусловлено клеточной дифференцировкой, возрастом человека и животного и видовой принадлежностью. Сравнение аминокислотной последовательности полипептидов аА и аВкристаллинов у представителей разных видов позволило установить, что два гена, кодирующих аА и аВсубединицы, почти не эволюционировали и, в среднем, за 0 миллионов лет изменились только на 3 три из 0 аминокислотных остатков i, . Хотя аА и аВсубъединицы акристаллина имеют близкую аминокислотную последовательность и аналогичную структуру , v , . Экспрессия аАкристаллина ограничиваетя, в основном, хрусталиком глаза и лишь незначительные его количества обнаруживаются в других тканях iiv . Вкристаллин экспрессируется во многих тканях, преобладая в мозге, сердце и мышцах ii, . Повышенная экспрессия аВкристаллина наблюдается при многих патологических процессах i, в ответ на термический . Сравнительный анализ первичной структуры показал, что, по всей вероятности, эти белки произошли от общего предка путем дупликации генов . Основываясь на экзонинтронной структуре гена, в составе можно выделить два домена терминальный домен, кодируемый экзоном 1 и Стерминальный или акристаллиновый домен, кодируемый экзонами 2 и 3. На конце домена находится учаток, так называемый мотив, содержащий относительно консервативную последовательность аминокислот . В Стерминапыюй части находится акристаллиновый домен, состоящий из 0 аминокислотных остатков. В отличие от терминалыюго домена эта последовательность высоко консервативна человека на гомологичен аАкристаллину мыши и на гомологичен аВкристаллину быка . В состав акристаллинового домена входит девять Ртяжей, собранных в два листа и короткая аспираль, расположенная между седьмым и восьмым ртяжами рис. На Сконце молекулы располагается короткая, вариабельная последовательность, которая по данным ЯМРспекгроскопии характеризуется высокой подвижностью и экспонирована в растворитель . В этой последовательности выявлены аспираль а2, короткая Рскладка рЮ и достаточно протяженные участки неупорядоченной структуры. Вторичная структура представлена преимущественно рскладками, в то время как доля аспиралей относительно мала i . Олигомеры млекопитающих, включая акристаллин, обладают динамичной структурой и в связи с этим получить их в кристаллическом виде и изучить структуру с помощью рентгеноструктурного анализа до сих пор не удается. Сведения об олигомерной структуре получены в основном из данных рентгеноструктурного анализа двух малых белков теплового шока 6,5 из термофильной археи ii i . Олигомерный комплекс 6,5 из М. Да, состоит из субъединиц и представляет собой сферу с внешним диаметром, равным нм. Внутри этой сферы имеется полость с диаметром 6. Олигомер 6,5 обладает октаэдрической симметрией и на его поверхности находятся восемь треугольных и шесть квадратных отверстий i .