Липид- и полисахаридкиназная активности антител молока человека

• Автор: Каратаева, Наталия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Киназы глицерофосфолипидов

1.1.1. Фосфатидилинозитол 3киназы

1.1.2. Фосфатидилинозитол 4киназы.

1.1.3. Фосфатидилинозитол4фосфат 5киназы

1.2. Киназы сфинголипидов.

1.3. Каталитически активные антитела

1.3.1. Моноклональные абзимы с синтетическими свойствами.

1.3.2. Механизмы генерации каталитически активных антител

1.3.3. Природные абзимы при аутоиммунных заболеваниях

1.3.4. Природные абзимы молока человека
1.3.4.1. Абзимы с иротеинкиназной активностью.
1.3.4.2. Иммуноглобулины класса А с липидкиназной активностью.
1.3.4.3. Абзимы с другими типами активностей
1.4. Защитные факторы молока человека.
1.4.1. Иммуноглобулины.
1.4.2. Липиды
1.4.3. Олиго и полисахариды.
2. МАТЕРИАЛЫ И хМЕТОДЫ.
2.1. Реактивы и материалы.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из молока человека
2.2.2. Кислый шок препаратов антител
2.2.3. Концентрирование препаратов антител
2.2.4. Определение концентрации белка.
2.2.5. Электрофоретический анализ белка.
2.2.6. Определение липидкиназной активности препаратов антител
2.2.7. Опредение полисахаридкиназной активности препаратов антител
2.2.8. Анализ стабильности комплекса олигосахаридов с антителами
2.2.9. Гидролиз 3Тмеченных олиго и полисахаридов
2.2 Определение протеинкиназной активности препаратов антител.
2.2 Гидрофобная хроматография антител на фенилсефарозе БЕВб.
2.2 Исследование взаимодействия антител с аффинными сорбентами.
2.2 Аффинная хроматография иммуноглобулинов на сорбентах
с иммобилизованными аити Iантителами.
2.2 Аффинная хроматография иммуноглобулинов на сорбентах с иммобилизованными антителами против легких цепей
2.2 Тестирование липидкиназной активности антител i i
2.2 Тестирование полисахаридкиназной активности антител i i
2.2 Получение и очистка фрагментов иммуноглобулинов класса А.
2.2 Получение и очистка фрагментов имуноглобулинов класса
2.2 Определение кинетических параметров реакции фосфорилирования.
2.2 Аффинная хроматография препарагов антител на АТРсефарозе
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Выделение иммуноглобулинов из молока
3.2. Исследование антител с липидкиназной активностью
3.2.1. Стабильность комплексов антитела липиды.
3.2.2. Анализ структуры эндогенных липидов.
3.3. Исследование антшел с полисахаридкиназной активностью.
3.3.1. Стабильность комплексов антитела сахариды.
3.3.2. Анализ структуры эндогенных олиго и полисахаридов
3.4. Доказательства принадлежности каталитической активности антителам.
3.4.1. Кислый шок препаратов антител.
3.4.2. Взаимодействие антител с аффинными сорбентами.
3.4.3. Тестирование препаратов антител i i.
3.5. Субстратная специфичность антител.
3.5.1. Липидкиназная активность антител
3.5.2. Олигосахарид киназная активность антител
3.6. Локализация активных центров антител
3.6.1. Каталитическая активность фрагментов иммуноглобулинов.
.7. Кинетические параметры реакции фосфорилирования липидов
.8. Кинетические параметры реакции фосфорилирования олигосахаридов
3.9. Возможная биологическая роль абзимов с киназными активностями
1. ВЫВОДЫ
2. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПАЛГ
ТХУ
АИЗ
ДНК
РНК
ТСХ
1АТР
ТТР
БТТ
З
вмз
РЦПБ
РкПпэ 3киназы Рип3,4Р2 Рсп4Р РсШю 4киназы Ркш4Р 5киназы РиПпя4,5Р
акриламид
полиакриламидный гель
. . , Мтетраметилэтилендиамин
трихлоруксусная кислота
этилеламилтетраацетат
аутоиммунные заболевания
антитела
дезоксирибонуклеиновая кислота каталитически активные антитела рибонуклеиновая кислота относительная активность тонкослойная хроматография аденозин5трифосфат дезоксиаденозин5трифосфат гуанозин5трифосфат тимидин5трифосфат циклический аденозинмонофосфат дитиотреитол додецилсульфат натрия дисиалоганглиозид 3 моносиалоганглиозид 1 моносиалоганглиозид 3 иммуноглобулин фосфатидшганозитол фосфотидилинозитол 3киназы фосфатидилинозитол3,4ди фосфат фосфагидилинозитол4фосфат фосфатидилинозитол 4киназы фосфатидилинозитол4фосфат 5 киназы фосфатидилинозитол4,5дифосфат
ВВЕДЕНИЕ


Другими известными процессами фосфорнлирования липидов являются фосфорилирование долихола в процессе гликозилирования белков в эндоплазматическом ретикулуме 8 и фосфорилирование церамида в эндоплазматическом ретикулуме и в синаптосомадьных пузырьках 9, . Фосфатидилинозитол 3киназы 3киназы являются одними из важнейших ршуляторных белков, которые находятся на пересечении различных сигнальных путей И. Обнаруженная у 3киназ двойная ферментативная активность липид и протеинкиназная, а также их способность активировать целый ряд сигнальных белков, включая некоторые белковые продукты онкогенов, определяет принципиальное значение данных липидкиназ в регуляции таких важнейших процессов клетки, как рост, выживание, старение и опухолевая трансформация И. К настоящему моменту в клетках млекопитающих обнаружено семь форм каталитической и пять форм ассоциированнойрегуляторной субъединиц фермента. Впервые 3киназная активность была обнаружена в клетках млекопитающих, а позднее и в других эукариотических клетках. Исследования влияния специфического ингибитора 3киназы вортманнина на активность фермента показали присутствие киназы в секреторных клетках молочной железы . Рис. Структура фосфатидилинозитола i. Р 4киназы и I4 5киназы фосфорилируют фосфоннозитолы по гидроксилу в 4 и в 5 положении инозитола с образованием 4Р и 4,5Рг, соответственно. В настоящее время выделяют четыре основных класса, составляющих суперсемейство 3киназ, отличающихся по аминокислотной последовательности каталитического домена . Существует членов этого суперсемейства, которые делятся на две большие группы. Первая группа это настоящие липидкиназы, которые обладают липид и протсинкиназной активностями. В эту группу входят классы IIII 3киназ. Вторую группу составляет IV класс 3киназ, проявляющих только протеинкиназную активность. Взаимодействие регуляторной субъединицы р с факторами роста ведет к стимуляции 3киназной активности. Каталитическая субъединица i находится на Сконце, который высоко консервативен и гомологичен у всех 3 и 4киназ, и имеет сходство с каталитическими доменами протеинкиназ . Данная субьединица обладает одновременно 3киназной и прогеинкилазной активностью серинтреонинового типа . Предполагается, что, благодаря способности регуляторной рсубъединицы взаимодействовать как с рецепторными тирозинкиназами, так и с каталитической р субъединицей, происходит транспортировка последней к клеточной мембране, где и инициируется образование комплекса фермента с глицерофосфолипидным субстратом ,. I vi субъединица р связывается с последовательностью XX в составе полипептидов наличие остатка фосфотирозина является существенным для связывания . I viv субъединица р связывается с активированными мембранными рецепторами, например, с рецептором фактора роста тромбоцитов и рецептором инсулина, которые имеют похожую аминокислотную последовательность. Связывание субъединицы р с рецептором и субъединицей i приводит к появлению активного 3киназного комплекса. I vi было показано, что субъединица i также способна проявлять каталитические свойства, но не способна связываться с фосфор илироваиным рецептором. Рис. Схематическая структура рр0гетеродимера. В состав регуляторной рсубъедииицы входят начиная с коица БНЗдомен, два пролинбогатых участка . БН2ломена, разделенные i2 i 2 участком, через который происходит связывание с каталитической i субъединицей. Стрелками указаны места связывания гетеродимера с основными активаторами 3киназы фосфотирозиновыми белками Р и малыми белками . I домены опосредуют белокбелковые взаимодействия в сигнальных путях, активируемых тирозин киназами. I домен взаимодействует с белками, содержащими пролин и гидрофобные остатки. Влимфоцитов. Описанный тип 3киназ по классификации авторов работы относится к классу 1. Данный класс является наиболее изученным классом по сравнению с другими представителями суперсемейства 3киназ, I vi показано, что ферменты данного класса фосфорилируют , 4Р и 4,5i с образованием ЗР. Р и 3. Рз. По механизму активации, класс I 3киназ делится на подклассы I и I 3. Л представлен гетеродимерными белками, состоящими из каталитической 0 кДа и регуляторной кДа субъединиц.