Конструирование и функционирование рекомбинантных белков, составленных из компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы

• Автор: Назаров, Павел Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Холестеринмонооксигеназнаялиазная система.

Общая характеристика адренодокснна.

Общая характеристика адренодоксинредукгазы.

Общая характеристика цнгохрома Рсс.

Механизм действия холестеринмонооксигеназнойлиазной системы.

Перенос электронов от ЫАПРН к адрснодоксину.

Возможные механизмы превращения холестерина в прегиенолои.

Взаимодействие адренодокснна с адренодоксинредуктазой и цитохромом РЬсс.
Топология и стехиометрия компонентов холсстеринмонооксигеназнойлиазной системы.
Регуляция активности холестеринмонооксигеназнойлиазной системы.
Гетерологическая экспрессия компонентов холестеринмонооксигеназнойлиазной системы в различных модельных объектах.
Системы экспрессии индивидуальных белковкомпонентов холестсринмонооксигеназнойлиазной системы.
Экспрессия гибридных слигых молекул, включающих компоненты Р0монооксигсназных систем.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы.
Реактивы и ферменты.
Использованные клеточные штаммы и плазмиды.
Методы.
Методы работы с ДНК.
Выделение ДНК.
Рестриктный анализ.
Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. Дефосфорилирование ДНК.
Модификация концевых участков ДНК.
Лигирование.
Полимеразная цепная реакция ПНР.
Секвенированис.
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках . i и
. vii.
Условия роста штаммов . vii.
Условия роста штаммов . i.
Трансформация клеток . vii.
Трансформация клеток . i.
Фракционирование клеток . i и . vii.
Выделение митохондрий из дрожжевых клеток.
Получение гомогената клеток i.
Получение вывернутых мембранных частиц клеток .i. Анализ образцов.
Определение содержания белка по Лоури.
Электрофорез по Лэммли.
Иммунобло пинг.
Экстракция вывернутых мембранных частиц Тритоном Х0. Карбонатная экстракция вывернутых мембранных частиц. Обработка митохондрий трипсином и протеиназой К.
Оценка содержания рекомбинантных белков.
П.П.5. Получение спектров рекомбинантных белков.
II.II.6. Определение ферментативной активности рекомбинантных
белков.
Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
П1.1. Результаты.
Ш.1.1. Гетерологическая экспрессия гибридных белков в клетках
vii.
Ш.1.1.1 Экспрессия гибридного белка 2.
П1.1.1.2 Холсстеринмонооксигеназнаялиазная активность
изолированных митохондрий, содержащих гибридный белок 2.
III.1.1.3 Совместная экспрессия цитохрома 0 и гибридного
белка в дрожжах. Определение холестеринлюнооксигеназнойлиазной активности при совместной экспрессии.
Ш.Н. Гетерологическая экспрессия гибридных белков в клетках
ii i.
1П.П. 1 Экспрессия гибридного белка .
Ш. II. 1.1 Конструирование рТгсАР .
III. II. 1.2 Идентификация гибридного белка РА.
III.1I. 1.3 Холестеринмонооксигеназнаялиазная активность
клеточных гомогенатов, содержащих гибридный белок .
III. II. 2 Экспрессия гомологических тройных гибридных белков.
Ш.Н. 2.1 Конструирование .
I 2.2 Конструирование рТгсАМАР .
Ш.П.2.2.1 Конструирование .
1П.Н.2.2.2. Конструирование .
1П.Н. 2.3 Идентификация продуктов экспрессии кДПК,
кодирующих гибридные белки и .
1 2.4 Холестеринмонооксигеназнаялиазная активность тройных
гомологических гибридных белков.
1 3 Экспрессия гомологических двойных гибридных белков.
ШЛ. 1.4 Конструирование рТгсАААЬ.
Ш.Н. 1.5 Конструирование рТгсЛРЛ1Ь.
III.П. 1.6 Конструирование рТгсАУЛ1РЬ.
П1.П. 3 Идентификация продуктов экспрессии кДНК, кодирующих
двойные гибридные белки.
II Холесгеринмонооксигеназнаялиашая активность
клеточных гомогенагов, содержащих гибридные белки. 2 Ш.П.6 Клеточная локализация гибридных белков.
1. II. 7 Спектральные свойства г ибридных белков.
Ш.Ш ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Цель настоящей работы состояла в том, чтобы исследовать эту проблему на примере холсстсринмонооксигсназнойлиазной системы митохондрий коры надпочечников, включающей цитохром 0, адренодоксин и адренодоксинредукгазу. С этой целью было осуществлено конструирование гибридов с различными комбинациями указанных белков, синтез гибридов в клетках vii и ii i и изучение их каталитических свойств. Хллестеринмоноокснгеназиаялназная система. Ферменты, катализирующие реакции, в которых один атом молекулярного кислорода внедряется в молекулу субстрата, а другой восстанавливается с образованием НгО, называют оксидазами со смешанными функциями или монооксигеназами. Одним из таких ферментов является холестсрннмонооксигеназалиаза, локатизованная в митохондриях коры надпочечников млекопитающих. Для монооксигеназных систем, локализованных в коре надпочечников млекопитающих, участвующих в биоси тезе кортикостероидов, характерна компартменталюация начальная и заключительная стадии биосинтеза осуществляются в митохондриях, а промежуточные реакции в микросомах клеток коры надпочечников. Кроме рассматриваемой нами холестеринмонооксигеназнойлиазной системы, к митохондриальным стсроидгидроксилирующим системам относится ПРстерондгидроксилаза осуществляющая конечные сталии биоситеза кортикостероидов. Ферментативные системы, включающие различные цитохромы Р0, деляг на несколько классов рис. Холестсринмонооксигеназная лиазная система представляет собой систему I класса Она состоит из флавопротеида атренодоксинредуктазы, железосодержащего белка адрснодоксина и крупного гемопротеида цитохрома Р0зсс. В настоящее время наиболее охарактеризованы белкикомпоненты холестеринмонооксигеназнойлиазной системы из коры надпочечников быка. Рисунок 1. Схематическое представление трех классов ферментативных систем, включающих цитохромы Р0 1. Система I класса включает три компонента содержшцую флавинодоксинрсдуктазу, РегЯгсодержшций флаводоксин и цитохром Р0. Многие бактериальные и все эукариотические митохондриальные Р0системы принадлежат к I классу. Ферментативная система И класса включает два компонента дифлавиновую редуктазу содержит и и цитохром Р0. К системам II класса относятся эукариотические мнкросомальныс Р0систсмы. Система III класса представляет собой цитохром Р0 и дифлавиновую редуктазу, слитые в единую полипеитидную цепь. Ферментативной системой III класса является лишь бактериальный цитохром Р0 ВМЗ. I.I. Адренодоксин относится к железосодержащим белкам, имеющим в своем составе , способным только к одноэлектронному восстановлению 3. Такие белки широко распространены в растениях, бактериях и животных. Молекулярный вес зрелого адренодоксина коры надпочечников быка составляет кДа. Белок состоит из 4 аминокислотных остатков4. Цистеины в положениях , , и участвуют в образовании кластсра рис. Замена любого из них на серии фатально влияет на образование Рекластера при экспрессии адренодоксина в . Рисунок 2. Участок адренодоксина, от вечающий за взаимодействие с РегБгкластером 4. Благодаря наличию простетической группы, спектры поглощения адренодоксина имеют характеристические полосы, которые обусловлены окисленным или восстановленным состоянием . Спектр поглощения окисленной формы белка характеризуется максимумами при 4 и 5 нм, а также широкой полосой поглощения в районе 0 нм. Восстановление дитионитом сопровождается исчезновением максимумов при 4 и 3 нм рис. Коэффициент молярной экстинкции, рассчитанный из величины поглощения простетической группы при 4 нм, составляет 9,8 мМ см1 и используется для точного определения концентрации очищенного белка в растворе 6. При сравнении первичных последовательностей ферредоксинов из различных источников была выявлена гомология между адренодоксином и путидаредоксином из i подобия, и между адренодоксином и терпредокешюм из подобия. Вторичная и третичная структуры являются более консервативными в сравнении с первичной последовательностью 4. Степень гомологии с адренодоксином человека составляет более 7. Рисунок 3. Спектр поглощения адренодоксина в окисленной форме 1 и после восстановления дитионитом 2 8.