Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии

• Автор: Рунова, Ольга Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 108 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика рецептора ЛНП.

1.2. Мультидоменная структура рецептора ЛНП.

1.3. Структурнофункциональная организация лигандсвязывающего

домена рецептора ЛНП.

1.4. Структура гена РЛНП.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы . i, питательные среды, условия роста.

2.2. Плазмидные векторы.

2.3. Выделение плазмидной ДНК.
2.4. Трансформация .i. г.
2.5. Гйбридизация.
2.6. Очистка рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП, слитого
с галактозидазой.
2.7. рЕТ система.
2.7.1. Индукция 3 лизогенов.
2.7.2. Получение клеточного экстракта и белков культуральной среды для хроматографии на смоле ii.
2.7.3. Подготовка смолы ii и аффинная хроматография.
2.8. Культивирование фибробластов человека линии НТ и получение
клеточных лизатов.
2.9. Получение антител к рекомбинантному лигандсвязывающему домену
РЛН человека.
2 Денатурация и рефолдинг рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП.
2 Оценка лигандсвязывающей активности рекомбинантного белка
в иммунохимическом тесте на микроячеечных планшетах.
2 Визуализация РЛНП в белках клеточных лизатов и рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП с помощью и ммуноблоттинга и лигандного блоттинга.
21. Иммуноблоттинг.
22. Лигандный блоттинг.
2 Аналитические методы.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВА1ИЙ.
3.1. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии X.
3.2. Выделение рекомбинантного лигандсвязывающего домена 1I1 в виде
слитого белка.
3.3. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии рЕТ.
3.4. Выделение лигандсвязывающего домена рецептора ЛНП в виде рекомбинантного индивидуального белка.
3.5. Характеристика антител к рекомбинантному лигандсвязывающему домену рецептора ЛНП.
3.6. Анализ функциональной активности рекомбинантного лигандсвязывающего
домена рецептора ЛНП.
3.7. Исследование взаимодействия белков ii i с ЛНП человека.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями 1 для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лигандсвязывающего домена 2 наличие индивидуального белка лигандсвязывающего домена РЛНП имеет существенное значение для выяснения функциональных последствий мутационных аминокислотных замен и делеций в этом домене 3 на основе рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП может быть создана простая бесклеточная тестсистема для изучения структурных аномалий ЛНПчастиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП 4 лигандсвязывающий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринсмии. Наряду с этими конкретными направлениями использования лигандсвязывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные как правило, концевые фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов i . . РНК, сдвига рамки считывания с ранней терминацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др. Рекомбинантные лигандсвязывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецепторлиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и но последовательности аминокислот лигандсвязывающему домену РЛНП и обладающий антивирусной активностью i . В связи с этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНП, так и созданию высокоспецифических способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме. Цели и задачи исследования. Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лигандсвязывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимичсской специфичности и функциональной активности. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих лигандсвязывающий домен РЛНП, на основе векторов серий X и рЕТ и плазмиды З, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках. Разработка процедур выделения рекомбинантного лигандсвязывающсго домена РЛНП в виде гомогенного белка. Полуденне антител к рекомбинантным белкам и изучение их специфичности и перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека. Оптимизация процедур восстановленияденатурации и рсфолдинга для получения функционально активного рекомбинантного белка, обладающего ЛНПсвязывающей активностью. Научная новизна работы. Впервые выделен и охарактеризован полноразмерный лигандсвязывающий домен РЛН человека продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах . Разработаны препаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановленияденатурации и последующего рефолдинга рекомбинантного лигандсвязывающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальцийзависимой ЛНПсвязывающей активности. Практическая значимость работы. Полученные антитела к рекомбинантному лигандсвязывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНП клеток человека и могут использоваться для его иммунохимической детекции в реакции иммуноблоттинга и количественного определения. Лигандсвязывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНПсвязывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тестсистемы определения аномальных ЛНП в крови человека и для специфической элиминации ЛМ из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии.