Клеточная интернализация экспрессионных генноинженерных конструкций при помощи лактоферрина

• Автор: Синогеева, Наталья Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 151 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава I. Генная терапия универсальный способ лечения различных заболеваний

Глава II. Рецепторные пути переноса генетического материала.

Глава III. Химические методы для синтеза коньюгатов на основе белковлигандов и белок

связывающих соединений

Глава IV. Невирусные способы доставки генетического материала.

Глава V. Лактоферрин

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава VI. Материалы и методы исследования
6.1. Трансформация . i
6.2. Выделение илазмидной ДНК.
6.3. Получение ЛФ.
6.3.1. Выделение и очистка ЛФ
6.3.2. Насышение ЛФ ионами железа
6.4. Синтез производных ЛФ
6.4.1. Получение иодуксусного ангидрида
6.4.2. Синтез К
6.4.3. Синтез К
6.5. Электрофорез в неденатурирующих условиях.
6.6. Электрофорез в денатурирующих условиях
6.7. Получение и характеристика моноспецифических антител против ЛФ
6.8. Ракетный иммунофорез
6.9. Иммуноблоттинг
6 Получение препаратов ЛФ, меченных ,1.
6 Измерение радиоактивности органов крыс после введения 1Ъ1К
6 Ретардация комплексов в агарозном геле.
6 Определение констант диссоциации комплекса ЛФ и плазмидной ДИК.
6 Определение влияния солей на комплексообразование ЛФ и его производных с плазмидной ДНК.
6 Лазерная корреляционная спектроскопия
6 Условия трансфекции клеточных культур
. Приготовление трансформирующих комплексов
. Трансформация клеток Нерв2 плазмидой рСМУЬасг в составе комплексов с ЛФ
. Трансформация клеток Нер плазмидой рСМУСа в составе комплексов с ЛФ.
.Трансформаиия миобластов С2С плазмидой рСМУЬис в составе комплексов с ЛФ.
6 Условия трансфекции животных.
. Условия внутривенной трансфекции крыс комплексом рСМУароЛ1К1.
. Условия внутривенной трансфекции мышей комплексом рЕОРРС3К1.
. Условия внутримышечной трансфекции мышей комплексами плазмидная ДНКЛФ.
6 Определение накопления продуктов экспрессии после трансфекции животных.
. ПЦРанализ после внутривенной трансфекции крыс комплексом рСМУароА1К1.
. Определение накопления продукта экспрессии в гомогенатах органов после внутривенной трансфекции мышей комплексами рЕСРРС3К
. Определение накопления продукта экспрессии в гомогенатах органов после внутримышечной трансфекции мышей комплексами рЕОРРСЗЛФ и рСМУЬасЛФ
. Определение накопления ргалактозидазы в целых мышцах после внутримышечной трансфекции мышей комплексами рСМУЬасЛФ и рСМУЬасХК1.
. Иммуноцитохимическое определение накопления дистрофина человека после
внутримышечной трансфекции xмышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава VII. Характеристика исходных препаратов
7.1. Характеристика ЛФ.
7.2. Синтез производных ЛФ.
7.3. Характеристика производных ЛФ.
7.4. Исследование органного распределния конъюгата К1.
Глава VIII. Характеристика взаимодействия ЛФ и его производных с плазмидными ДНК.
8.1. Электрофорез в агарозе комплексов плазмид с ЛФ и его производными.
8.2. Анализ нуклеотидных последовательностей плазмидных ДИК
8.3. Определение констант диссоциации комплексов плазмид с немодифицированным ЛФ.
8.4. Определение влияния солей на комплексообразование ЛФ с плазмидными ДНК
8.5. Определение гидродинамических размеров комплексов плазмид с ЛФ.
Глава IX. Доставка маркерных генов в культивируемые клетки млекопитающих
9.1. Трансформация клеточных культур комплексами плазмидаЛФ
9.2. Трансформация клеток 2 плазмидой V в комплексе с К1 или К2.
9.3. Трансформация клеток 2 плазмидой V в комплексе с К
9.4. Трансформация миобластов С2С плазмидой V в комплексе с К1.
Глава X. Трансфекция лабораторных животных содержащими ЛФ комплексами.
.1. Доставка маркерных генов при помощи внутривенного введения в составе комплексов с К1.
.1.1. Доставка V при помощи внутривенного введения в составе комплексов
.1.2. Доставка 3, V при помощи внутривенного введения в составе комплексов с К
.2. Доставка репортерных генов в составе комплексов с ЛФ после внутримышечного введения.
.2.1. Доставка V, комплексированной с ЛФ, при внутримышечном введении.
.2.2. Доставка V и З в составе комплексов с ЛФ после внутримышечного введения
.2.3. Доставка в миофибриллы мутантных по дистрофину мышей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Найдено, что доставляемые при помощи ЛФ гены экспрессируются в трансформированных клетках. Трансформации подвергаются как клеточные культуры, так и клетки в составе организма. Показано, что комплексы ЛФ ДНК достаточно эффективно внедряются в мышечные волокна, направляют синтез дистрофина человека у мутантных по дистрофину мышей. Предложены новые способы синтеза белковых конъюгатов, которые исключают гомополимеризацию белков и ДНКсвязывающих соединений. Охарактеризованы физикохимические параметры взаимодействия ЛФ с плазмидными ДНК, в частности, измерены константы диссоциации и установлены размеры образующихся комплексов. Апробация нового способа трансгеноза на линейных xмышах позволяет увеличить список методов лечения тяжелого наследственного моногенного заболевания миодистрофии Дюшепна. Апробация работы. Результаты исследования доложены на Втором Съезде Биохимического Общества Российской Академии Наук, Москва, мая, г. Iой медикобиологической конференции молодых ученых СанктПетербурга, СанктПетербург, ноября г. Международной конференции по медицине для молодых ученых, Люблин, Польша, апреля, г. России с международным участием Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, посвященной 0легию ММА им. И.М. Сеченова, Москва, г. Международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация, Пущино, сентября, г. Геном человека , Черноголовка, февраля, г. Международном Конгрессе Геном Человека, Брисбон, Австралия, марта, г. Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин i, Германия, октября, г. Международном симпозиуме по трансплантации и генной терапии. ИдарОбсрштайн, Германия, октябрь, г. Европейского общества генной терапии аббревиатура ЕЧАКЗТ, Мюнхен, Германия, ноября, г. Современные медицинские технологии, Новосибирск, ноября, г. Основные положения, выносимые на защиту. Предложен способ химического синтеза межмолекуляриых конъюгатов белков и ДНКсвязывающих соединений для комплексирования с плазмидами. Выявлены особенности взаимодействия различных плазмид, содержащих маркерные экспрессируемые гены, с очищенным ЛФ человека и с конъюгатами этого белка. Впервые доказана возможность использования ЛФ человека и конъюгатов данного белка для переноса репортерных или целевых генов в клеточные культуры и в ткани лабораторных животных. Показано, что при внутримышечном введении мутантным по дистрофину мышам модель миодистрофии Дюшенна комплексов ЛФ и конъюгатов ЛФ с плазмидой, содержащей ген дистрофина человека, в мембранах мышечных волокон накапливается дистрофии человека. Структура диссертации. Диссертация изложена на 1 страницах и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение исследований, заключение и выводы. Работа иллюстрирована рисунками, 6 диаграммами и 7 таблицами. Список литературы содержит 6 названий работ на русском и английском языках. Глава I. Генная терапия это коррекция патологического фенотипа путем введения новой генетической информации в пораженный организм. Она характеризуется переносом генетической информации пациентам при помощи технологий рекомбинантных ДНК. Цель гелиотерапевтических процедур не изменить весь генотип, но видоизменить свойства индивидуальных клеток, в частности, усилить способность пациента бороться с генетическим или приобретенным заболеванием. Основной целью генной терапии является полное восстановление генетических дефектов. Чужеродный генетический материал может быть введен в компетентные клетки i viv или i vi. В последнем случае необходима дальнейшая доставка модифицированных клеток в соответствующее место организма. В проектах по генной терапии разрабатываются принципы лечения как наследственных моногенных заболеваний, гак и приобретенных болезней типа рака или СПИДа. Всего, начиная с года, было проведено 9 клинических исследований на пациентах. При этом какихлибо вредоносных эффектов или значительной токсичности обнаружено не было , . Устойчивый лечебный эффект был достигнут при работе с больными хронической грануламатозной болезнью, гемофилией и раковыми заболеваниями.