Кинетика электрогенного транспорта двухвалентных катионов в митохондриях

• Автор: Каспаринский, Феликс Освальдович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Роль МИТОХОНДРИЙ В МЕТАБОЛИЗМЕ КАЛЬЦИЯ.

. 1 Участие ионов кальция л регулировании метаболизма

1.2 Коюпроль растгределепим внутриклеточною кальция.

1.3 Проведение кальциевого сигнала из цитозоля в матрикс митохондрий.

2. ЭЛЕКТРОГЕЯНЫЙ ТРАНСПОРТ ДВУХВ А1ЕН7НЫХ КАТИОНОВ В МИТОХОНДРИЯХ. .

2.1 Молекулярный механизм транспорта 3.

2.2 Движущая сила аккумуляции 2 в митохондриях.

2.3 Ка.гьциеая емкость митохондрий.
2. Контроль трансмембранного распределения Лг
2.5 Кинетика транспорта 2.
.1 К, V1 транспорта Мег .
.2 Кииеппа насыщения начальных скоростей транспорта .
.3 Ллдостерическая дкгиплния транспорта двухвалентных катионов
.4 Быстрое поглощение Сав . . .
.5 Субстратная специфичность Сауиипоргера .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. МАТЕРИАЛЫ.
2. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
2. Очистка реакционных сред от примесного .
.1 Подготовка смолы i I7I8 к работе . .
.2 Приготовление ионообменных колонок со смолой ii I8
.3 Ислольованис ионообменных колонок со смолой i I3.
2.2 Получение препаратов ичяхироваюшх митохондрий из печени крысы.
2 2.1 Стандартна процедура выделения митохондрий
.2 Модификации стандартной процедуры выделения митохондрий ааа .
.2.1 Поиск способа уменьшения содержания Са в препаратах митохондрий.
2 2.2.2 Процедура получения препаратов митохондрий с пиисим содержанием Са. .
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
3.1 Определение концентрации ионов 3 и Со3 и Мп2 е стандартных растворах i. СаС1 и Лл С. .методом комплексонометрического титрования.
3.1.1 Титрование раствора кадьмагитом или ориохромом черным Т .
3.1.2 Титрование растворов I и i с халысоиом.
3.2 Оценка концентраций Со2 в средах и содержания Со2 в митпохондриях.
3 2 Регистрация митохондриального транспорта Л
3.4 Регистрация изменений мембранного потенциа.ш .митохондрий.
3.5 Измерение скорости дыхания митохондрий.
3 6 Определение концентрации белка митохондрий
4. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ.
4.1 Среды
4.1.1 Срси выделения .
4.1.2 Среда промывки .
4.1.3 Среда измерения . .
4.2 Ме2зависимая активация митохондриального транспорта Мег
4.2.1 Активация Са2 унилортерл в густой суспензии митохондрий. .
4. Активация тракиорта Ме2 в среде измерений
4.1 Деактивация мтюхондриального транспорта Ме2.
4.3.1 Деактивация Сауиипортера в густой суспензии митохондрий. .
4.3.2 Деактивация Олуиипортера митохондрий в среде измерений
4.4 Концентмгция .митохондрий в среде измерений
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Влияние влтримнтохондги.лыюго Са на активность Саунипортера.
2. МЕЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ САУН И ПОРТЕ РА С ВНЕШНЕЙ СТОРОНЫ ВНУТРЕННЕЙ митохондриальной мембраны
2.1 Кинетика Со9 зависимой активации транспорта Со
2.2 Специфичность активации Ссгунинортера деухва.игопниии катионами.
2.3 Влияние температуры на активацию Сагунипортера
3. Кинетика транстюртд дву,халнтшх катионов
3.1 Начальная скорость транспорта Ме
3.2 В.паснис Со2заеисииой ахтияации Са2унипортера на кажущийся порядок транспортной реакции .
3.3 Кинетика насыщения скоростей транспорпа Ме
3.4 Специфичность транспорта двухвалентных катионов .
I. Обратимость активации Саунипортера
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ .ммммим.ммиммм.1.ммимммит1миии.1мм.мми1и.миниммнимиимммтмнмп1.миим1
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Снижение концентрации Са2 в цитозоле любых типов клеток обеспечивается пассивными и активными механизмами. В первом случае уровень Са2 регулируют специальные белки , 3 и фосфолипиды , 6, а во втором Са2транспортирующие системы плазмалеммы , сарко и эндоплазматического ретикулума , 9, а также Аппарата Гольджи 8 и митохондрий . В последнее время накопилось достаточно много свидетельств в пользу того, что функции мембранных систем, участвующих в регулировании концентрации Са2, сводятся не столько к стабилизации уровня катиона в цитозоле, сколько к модулированию амплитуды, продолжительности и частоты изменений концентрации Са2, а также их пространственной локализации этих Са2волн . Несмотря на различия в метаболизме клеток возбудимых и невозбудимых тканей, тушение и проведение Са2сигнала подчиняется общим закономерностям. Одним из основных факторов, определяющих относительную роль системрегуляторов уровня Са2 является концентрация Са1 в цитозоле. При повышении концентрации этого катиона до нМ активность Сатранслортирующих систем плазмалеммы иили эндоплазматического ретикулума обеспечивает порядка тушения Са2сигнала . Роль плазмалеммы и митохондрий в контролировании одиночных мышечных сокращений минорна в сравнении с саркоплазматическим ретикулумом 3. Об этом свидетельствует увеличение времени релаксации кардиомиоцитов и ный рост амплитуды систолических Са2волн в присутствии ингибиторов митохондриального транспорта Са 5. В клетках невозбудимых тканей возвращение к стационарной концентрации цитозольного Са2 в интервале нМ обеспечивается одновременным поглощением катиона как в эндоллазматический ретикулум. Общая Са2нагрузка гепатоцитов при этом увеличивается от 1 до 5 нмольмг сухого веса клетки. Однако емкость эндоплазматического ретикулума не превышает нмольмг клеточного белка и после его насыщения главным Са2буфером клеток печени становятся митохондрии, накопившие более 4 нмоль Са2мг белка 9. Если амплитуда Са2волн позволяет преодолеть концентрационный порог, равный 0 нМ происходит кооперативная активация митохондриального транспорта Са2, в результате чего более Са2 оказывается в матриксе этих органелл . При этом митохондрии забуферивают концентрацию внешнего Са2 в диапазоне 0 нМ . Самг 2. Диапазон буферного действия митохондрий определяется тканеслецифичностью состава цитозоля 5. Большая вместимость митохондриального компартмента в сочетании с кооперативностью при поглощении Са2 может оказаться решающим фактором при защите нейроцитов от токсических повреждений 1, 4. С другой стороны, эта же совокупность свойств становится причиной перегрузки митохондрий ионами Са2, что может приводить к повреждению нейроцитов и миоцитов при их избыточном возбуждении или в случае постишемической реперфузии 3. Наблюдения за пространственным распределением Са2 в интактных клетках невозбудимых и возбудимых тканей при помощи специфически адресованного химерного экворина показали, что i viv цистерны эндоплазматического ретикулума могут приближаться к митохондриями на расстояние менее нм 3. При физиологически опосредованном освобождении Са2 из ретикулума такие близкие контакты могут обеспечивать на порядка большие изменения концентрации Са2 вблизи митохондрий по сравнению с цитозолем . Подобное же сопряжение обнаружено между потенциалзависимыми каналами плазмалеммы, эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями 5. Поглощение Са2 в митохондрии затрудняет Са2зависимую активацию рианодиновых рецепторов при освобождении Са2 из ретикулума. Показано, что цистерны эндоплазматического ретикулума, расположенные в областях клетки с пониженным содержанием митохондрий, обладают более высокой чувствительностью к миоинозитол1,4,5трисфосфату, и наоборот. Благодаря митохондриальному транспорту Са2 создаются предпосылки для появления субклеточной неоднородности реакций на стимулы, сопряженные с появлением Са2сигналов из ретикулума . С другой стороны, Са2 сигналы, испускаемые ретикулумом в ответ на гормональную стимуляцию, могут усиливаться митохондриями и передаваться на значительные расстояния благодаря эстафетной индукции контролируемой неспецифической проницаемости 0.