Кинетический механизм реакции синтеза АТР, катализируемой F1-F0-АТРазой субмитохондриальных частиц

• Автор: Галкин, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
пгопп гттгтзaTi/nt-t &
jr JXJTXX.CX'.tt.X J X"XJl
ГЛАВА 1. ПРЕПАРАТЫ АТРаз FjF0 ТИПА
ГЛАВА 2. СТРУКТУРА Н+- АТР - СИНТЕТАЗЫ
2.1. Структура фактора Fj
2.2. Структура фактора Fo
ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АТРАЗЫ СО
СВОИМИ ЕСТЕСТВЕННЫМИ ЛИГАНДАМИ
3.1. Связывание нуклеотидов с фактором Fj
3.2. Функции центров прочного связывания нуклеотидов
3.3. Функционально-важные аминокислотные остатки, входящие в состав
нуклсотадсвязывающих центров
3.4. Связывание фосфата с фактором Fj
3.5. Взаимодействие FjFq-АТРэзы с ионами металлов
ГЛАВА 4. РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ F-АТРазой
4.1. Реакция синтеза АТР
4.2. Реакция гидролиза АТР
ГЛАВА 5. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ Н+-АТР-СИНТЕТАЗЫ.
5.1. Гипотезы сопряжения
5.2. Структурно-функциональные основы сопряжения
ГЛАВА б. ПРОБЛЕМА ОБРАТИМОСТИ АТРАЗНОЙ РЕАКЦИИ
6.1. Эффекторы FjFq-АТРэзы

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ
ГЛАВА 2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ,
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА I. КИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕАКЦИИ СИНТЕЗА АТР
ГЛАВА П. "СКРЫТАЯ” Дрн+ -ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ (М82+)АБР-
БЛОКИРОВАННОЙ АТРазы
ГЛАВА Ш. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА "СКРЫТОЙ" Дцн+-ЗАВИСИМОЙ АКТИВАЦИИ (М£2+)АБР-БЛОКИРОВАННОЙ АТРазы
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Синтез АТР в митохондриях осуществляется сложным протеопитвдным комплексом - FjFq-АТРэзой. Для протекания реакции синтеза АТР необходим трансмембранный градиент протонов (ДДд+) . В ходе ДрЦ+-зависимого синтеза АТР осуществляется сопряжение векторного переноса протонов и скалярной реакции образования фосфоэфирной связи. Механизм этого сопряжения не установлен, несмотря на большое количество экспериментальных данных. Большинство авторов, изучая гидролиз или синтез АТР, явно или неявно отождествляют механизмы прямой и обратной реакции. Однако целый ряд экспериментальных данных, касающихся взаимодействия АТРазы с нуклеотидами и другими естественными лигандами, указывает на то, что механизмы синтеза и гидролиза АТР могут различаться. Прежде всего это вытекает из существования односторонних ингибиторов АТРазы (тормозящих только либо АТРазную, либо АТР синтетазную активность). Одним из таких ингибиторов является ADP. Прсинкубация АТРазы с ADP в низкой концентрации в присутствии ионов магния приводит к шстсрсзисному поведению фермента в АТРазной реакции. При этом блокируется гидролиз АТР,
однако скорость синтеза АТР не меняется. Подробное изучение параметров

(Mgz )ADP-зависимого торможения АТРазной активности привело к возникновению гипотезы о различии путей синтеза и гидролиза АТР, катализируемых митохондриальной АТРазой. Согласно этой гипотезе, фермент может находиться в двух функционально различных состояниях: "синтстазном” и "щцролазном”, а переход из одной формы в другую контролируется нуклеотидами - ADP и АТР. В связи с этим становится очевидным, что нельзя исходя из данных о гидролизе АТР судить о механизме синтстазной реакции. Следовательно, необходим обстоятельный кинетический анализ реакции синтеза
4.2. Реакция гидролиза АТР.
Реакция гидролиза АТР является экзсргонической. При гидролизе AIP, катализируемом мембраносвязанной F j Fg-АТРазой, образуется Дрд+ на мембране. В отличие от АТРаз P-типа, в ходе гидролиза АТР ферментом FjFq-типа не образуется ковалентных интермедиатов. Это указывает на то, что АТРазная реакция протекает по механизму нуклеофильного замещения при атоме фосфора; в ходе реакции происходит инверсия конфигурации атомов кислорода при у-фосфатс AIP [9]. In vivo гидролизовать АТР с высокой скоростью способны бактериальные FjFq-АТРазы. В определенных условиях (например, при удалении белкового ингибитора) митохондриальная АТРаза также гидролизует АТР. В хлоропластной и EFj-АТРазе роль белка-ингибитора выполняет, по-видимому, в субъединица. АТРазная активность растворимого EFj ингибируется по неконкурентному механизму по отношению к АТР с Kj=lG нМ [203]. Для того, чтобы CFjFq (или CFj) был способен с высокой скоростью гидролизовать АТР, необходимо, чтобы в у субъединице была восстановлена дисульфидная связь, образуемая двумя остатками цистсина. In vivo эта связь, как полагают, восстанавливается при участии тиоредоксина. In vitro это осуществляют с помощью дюиатрсигала. Для активации каталитической активности фермента (как гидралазной, так и синтетазной), кроме восстановления дисульфидной связи необходимо наличие АрН на мембране. Грабсром обнаружено, что и окисленный и восстановленный CFj Fo может на свету ( в присутствии АрН ) переходить в активное состояние; однако для восстановленной формы фермента нужно гораздо меньшее значение АрН, чтобы перейти в активное состояние, чем для окисленной [93].
Общепринято, что субстратом АТРазной реакции является комплекс М&АТР [98]. Вместе с тем рад авторов рассматривают возможность того, что свободная форма АТР есть в действительности субстрат гидролиза АТР, а