Каталитические свойства НАД- и НАДФ-малатдегидрогеназ при токсическом поражении печени крыс

• Автор: Михайлова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 182 с. : ил.

1.1.1. Общая характеристика гепатитов

1.1.2. Создание модели токсического гепатита при помощи ССЦ

1.2. Оксидативный стресс и антиоксидантная система организма

1.2.1. Свободнорадикальное окисление биомолекул

1.2.2. Героксидное окисление липидов и его роль

1.2.3. Образование активных форм кислорода и их биологическое

значение в клеточном метаболизме

1.2.4. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе

токсического гепатита

1.2.5. Антиоксидантная система организма

1.3. Характеристика НАД и НАДФзависимых малатдегидрогеназ из

различных источников
1.3.1. Общая характеристика малатдегидрогеназной активности
1.3.2. Характеристика НАДзависимой малатдегидрогеназы
1.3.2.1.Функции и распространение НАДмалатдегидрогеназы в живых
организмах
1.3.2.2. Изоформы НА Дзависимой малатдегидрогеназы
1.3.2.3.Очистка НАДмалатдегидрогеназы из различных объектов
1.3.2.4.Исследование структуры и активного центра фермента
1.3.2.5. Кинетическое поведение и регуляция активности НАДзависимой малатдегидрогеназы
1.3.2.5.1.Кинетика и сродство к субстратам и кофакторам
1.3.2.5.2.Влияние температуры и
1.3.2.5.3.Регуляция активности НАДзависимой малатдегидрогеназы
1.3.3. Характеристика НАДФзависимой малатдегидрогеназы
1.3.3.1. Внутриклеточное распределение НЛДФзависимой
малатдегидрогеназы и ее роль в физиологобиохимических
процессах
.3.2.Очистка НАДФмалатдегидрогеназы из различных объектов
1.3.3.3.Исследование активного центра и структурной организации
НАДФмалатдегидрогеназы
. Кинетические и регуляторные свойства НАДФзависимой
малатдегидрогеназы
1.3.3.4.1.Сродство к субстрату и кофакторам. Аллостерические свойства
1.3.3.4.2.Влияние и температуры на функционирование фермента
1.3.З.4.З.Регуляция активности НАДФмалатдегидрогеназы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования
2.2. Создание модели экспериментального токсического гепатита
2.3. Определение активности ферментов
2.4. Определение содержания белка
2.5. Выделение и очистка ферментов
2.5.1. Экстракция
2.5.2. Получение субклеточных фракций гспатоцитов
2.5.3. Фракционирование сульфатом аммония
2.5.4. Гельфильтрация на сефадексе 0
2.5.5. Ионообменная хроматография на ДЭАЭцеллюлозе
2.5.6. Гельхроматография на Тоуореаг1 НУ
2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции
активности ферментов
2.7. Аналитический электрофорез
2.8. Определение молекулярной массы ферментов
2.9. Статистическая обработка результатов
3.2.
4.2.
4.4.
4.5.1. 4.5.2.
ГЛАВА 3. АКТИВНОСТЬ, СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ
И ОЧИСТКА НАД И НАДФЗАВИСИМЫХ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ
Субклеточная локализация и активность НАД И АДФ
малатдегидрогеназ из гепатоцитов крыс в норме и при токсическом гепатите
Очистка НАД и НАДФзависимых малатдегидрогеназ из печени
крыс в норме и при токсическим гепатите
ГЛАВА 4. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ, КИНЕТИЧЕСКИЕ И
РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА НАДМАЛАТДЕ1 ИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ СС Молекулярная масса митохондриальной и цитоплазматической
НАДзависимой малатдегидрогеиазы
Исследование кинетических параметров каталитического действия
НАДмалатдегидрогеназы в норме и при экспериментальном токсическом гепатите
Влияние среды на активность митохондриальной и
цитоплазматической НАДмалатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в норме и при введении гепатогоксина
Влияние температуры на активность НАДмалатдегидрогеназы
Регуляторные свойства митохондриальной и цитоплазматической
НАДзависимой малатдегидрогеиазы из печени крыс в норме и при патологии
Влияние ионов некоторых металлов и пероксида водорода на
активность НАДзависимой малатдегидрогеиазы
Исследование регуляции активности НАДзависимой
малатдегидрогеиазы из печени крысы в норме и при гепатите под действием аденозинфосфатов
. 4.5.3. Влияние глутатиона на функционирование НАД
малатдегидрогеназы из печени контрольной группы крыс и животных с токсическим гепатитом
4.5.4. Регуляция активности НАДзависимой малатдегидрогеназы
интермедиатами цикла трикарбоновых кислот
ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 0 НАДФЗАВИСИМОЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ
. 5.1. Молекулярная масса НАДФмалатдегидрогеназы из печени
контрольных и подвергнутых воздействию гепатотоксина крыс
5.2. Кинетические характеристики НАДФмалатдегидрогеназы 2 из гепатоцитов крыс в норме и при патологии
5.3. Влияние среды на активность НАДФзависимой
малатдегидрогеназы из гепатоцитов крыс в норме и при токсическом гепатите
5.4. Исследование влияния температуры на активность НАДФ
малатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при патологии
. 5.5. Исследование регуляторных свойств НАДФзависимой
малатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при токсическом гепатите
5.5.1. Влияние ионов некоторых металлов и пероксида водорода на 0 активность НАДФзависимой малатдегидрогеназы
5.5.2. Регуляция активности НАДФзависимого фермента с помощью 4 глутатиона
5.5.3. Влияние аденозинфосфатов на активность НАДФ
малатдегидрогеназы
. 5.5.4. Исследование влияния интермедиатов цикла Кребса на НАДФ
малатдегидрогеназу из гепатоцитов конзрольных крыс и животных, подвергнутых воздействию СС
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


К числу ксенобиотиков с наиболее высокой степенью избирательной гепатотоксичности относятся хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан 6. Модель токсического поражения четыреххлористым углеродом общеизвестна и принята во всем мире , 4, 9, 0, 0, 7, 9. Отравление экспериментальных животных этим ксенобиотиком но морфологической характеристике и биохимическим изменениям близко к острым поражениям печени различной этиологии у человека. В связи с особенностями молекулярных механизмов действия тетрахлорметана на субклеточные мембраны гепатоцитов изучение его биологического действия представляет интерес как модель молекулярной патологии мембранных структур. Развитие ультрасгруктурных изменений в гепатоцитах в свою очередь приводит к изменению взаимодействия ферментов с мембранами. При остром ССЦгепатите у крыс возникали глубокие нарушения морфогистохимических показателей печени в виде диском плектации печеночных балок, расширения вокругсинусоидных пространств, макро фатальнолимфоцитарный инфильтрации, жировой, белковой дистрофии и некроза гепатоцитов, снижение содержания рибонуклеиновой кислоты, султ. А сопровождалось увеличением содержания общего билирубина, ухудшал экскреторную функцию печени. Экспериментальное поражение печени сопровождалось также увеличением содержания изолированных двойных связей, диеновых конъюгатов, триеновых конъюгатов, глюкозоаминогликанов в тканях печени. ССЦ оказывает прямое повреждающее действие на печет посредством образования ковалентных связей с клеточными макромолекулами пероксидом водорода, перекисными соединениями липидов или гидроксильными радикалами, что, в свою очередь, приводит к нарушению целостности клеточных мембран и инактивации важнейших ферментных систем 3 , 0. Печень является главным органом метаболизма ксенобиотиков. Окислительный метаболизм веществ катализируется цитохром Р0зависимой монооксигеназной системой и другими ферментами. Благодаря реакциям окисления многие ксенобиотики, первично нетоксичные для печени, способны превращаться в токсические метаболиты. В реакциях второй фазы образованные метаболиты конъюгируют с эндогенными молекулами, что приводит к уменьшению токсичности, повышению водорастворимости и облегчает выведение ксенобиотиков почками . Из проведенных исследований на животных известно, что при экспериментальном воспроизведении токсического гепатита происходит значительная интенсификация свободюрадикального окисления , 7. Свободнорадикальное окисление СРО это совокупность реакций оксигеназного типа окисления, т. Свободными радикалами называют молекулы или структурные фрагменты молекул, у которых на внешней оболочке имеется один или несколько непарных электронов. По типу образования свободные радикалы можно разделить на три типа. Первичные радикалы это радикалы, образование которых осуществляется при участии определенных ферментных систем семихиноны, образующиеся в реакциях таких переносчиков электронов, как . Образование вторичных радикалов связано со СРО жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран и при соединении вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других, легко окисляющихся соединений, образуются третичные радикалы . Основной мишенью свободных радикалов являются ненасыщенные связи в липидах мембран , ,. Свободные радикалы, играющие важную роль в живой клетке это радикалы кислорода, ненасыщенных жирных кислот в составе липидов и фенольных производных, таких как флавин, токоферол и другие . Необходимо отметить, что субстратами СРО являются многие биологически важные соединения белки, аминокислоты, углеводы . Но в организме млекопитающих первостепенное значение имеет свободнорадикальное пероксидное окисление липидов, протекающее преимущественно в биологических мембранах. Эго, повидимому, связано с тем, что активные формы кислорода имеют наиболее высокую константу взаимодействия с полиненасыщенными жирными кислотами, являющимися основным компонентом мембранных фосфолипидов , 9. Пероксидация липидов вносит определенный вклад в патогенез заболеваний практически всех систем организма, в том числе и печени.