Карбогидразы : Препаративное получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахариды

• Автор: Корнеева, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 311 с. : ил

Оглавление
Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Карбогидразы, их классификация и биологическая

характеристика. Гидролиз олиго и полисахаридов

1.1. Общие закономерности ферментативного гидролиза олиго

и полисахаридов

1.2. Характеристика отдельных представителей карбогидраз

и их субстратов

1.3. Микробный синтез карбогидраз

1.4. Конститутивная и индуцибельная природа карбогидраз. Индукция и репрессия синтеза.
1.5. Физикохимические свойства карбогидраз
1.6. Современные представления о структуре карбогидраз.
1.7. Структура активных центров карбогидраз
1.8. О механизе расщепления гликозидных связей под действием карбогидраз
1.9. Перспективы практического применения карбогидраз
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследований .
2.1. Объекты исследований
2.1.1. Культивирование ацетонобутиловых бактерий.
2.1.2. Культивирование продуцентов ргалактозидазы
2.1.3. Культивирование микромицетов продуцентов Рфруктофуранозидазы и инулиназы.
2.2. Определение активности гликозидаз
2.2.1. Определение активности ссамилазы.
2.2.2. Определение активности глюкоамилазы.
2.2.3. Определение активности Ргалактозидазы
2.2.4. Определения активности инулиназы
2.2.5. Определение активности 3фруктофуранозидазы
2.3. Приготовление субстратов.
2.4. Выделение и очистка карбогидраз
2.4.1. Получение спиртоосажденных ферментных препаратов
2.4.2. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония.
2.4.3. Ультрафильтрация.
2.4.4. Ионообменная колоночная хроматография
2.4.5. Хроматография на ДЭАЭцеллюлозе.
2.4.6. Электрофорез.
2.4.7. Очистка инулиназы
2.5. Кристаллизация инулиназы А. ауатоп.
2.6. Определение молекулярной массы ферментов.
2.7. Определение мРНК и аминокислотной последовательности инулиназы.
2.8. Идентификация аминокислотных остатков
2.8.1. Модификация имидазольной группы
диэтилпирокарбонатом.
2.9. Методы контроля ацетонобутилового брожения.
2 Общие методы
2 Статистическая обработка экспериментальных данных.
Глава 3. Биосинтез карбогидраз микроорганизмами
3.1. Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез карбогидраз при глубинном культивировании микроорганизмов.
3.2. Влияние влажности питательной среды и крахмалистости отрубей на биосинтез карбогидраз при поверхностном культивировании
3.3. Влияние некоторых физикохимических факторов на
биосинтез карбогидраз
Глава 4. Препаративное получение карбогидраз и исследование
их физикохимических свойств
4.1. Очистка аамилазы и глюкоамилазы . i
4.2. фракционирование и очистка галактозидазы и фруктофуранозидазы.
4.3. Очистка и кристаллизация инулиназы . i .
4.4. Исследование каталитических свойств карбогидраз
4.4.1. Оптимальные значения и температуры
для действия карбогидраз
4.5. Исследование кинетики кислотной и термической инактивации карбогидраз
4.5.1. Влияние на стабильность аамилазы ii i.
4.5.2. Термическая инактивация аамилазы.
4.5.3. Кислотная и термическая инактивация глюкоамилазы, инулиназы, галактозидазы
и фруктофуранозидазы
4.5.4. Термодинамические характеристики процесса инактивации карбогидраз
Глава 5. Особенности структуры активного центра карбогидраз
и механизма их каталитического действия.
5.1. Нуклеотидная последовательность мРНК и аминокислотная
последовательность инулиназы.
5.1.2. Гликозилирование карбогидраз
5.2. Идентификация каталитически активных групп карбогидраз
5.2.1. Идентификация каталитически активных групп карбогидраз по кривым зависимости
активности от .
5.2.2. Теплота ионизации каталитически активных групп карбогидраз
5.2.3. Идентификация имидазольной группы карбогидраз фотоокислением.
5.2.4. Ингибирование специфическими реагентами.
5.3. Исследование механизма ферментативного катализа
олиго и полисахаридов.
5.4. Специфичность действия карбогидраз
5.4.1. Кинетика действия и субстратная специфичность
инулиназы А. ауатог
Глава 6. Применение карбогидраз в пищевой промышленности и биотехнологии
6.1. Применение амилолитических ферментов для снижения вязкости сбраживаемых сред в процессе
ацетонобутилового брожения.
6.2. Получение и применение биогидролизатов лактозных сиропов
6.3. Ферментативный гидролиз инулинсодержащего сырья
6.4. Использование инулиназы при сбраживании топинамбура в этанол.
6.5. Сбраживание топинамбура дрожжами рода К1иууеготусе
Общие выводы
Список литературы


Дрожжи обладают более низкой способностью к биосинтезу аамилазы. Так, из 7 испытанных штаммов дрожжей и подобных им микроорганизмов лишь 8 синтезировали данный фермент 4. Амилаза обнаружена среди базидиомицетных дрожжей iii i 8. Ранее считалось, что продуцентами амилазы являются лишь высшие растения. Впервые в нашей стране у микроорганизмов этот фермент был обнаружен Двадцатовой в х годах в культуре i , а впоследствии и во многих других . Многочисленные работы . Среди микроскопических грибов, продуцирующих амилазу, следует отмстить следующие . Амилазу продуцируют термофильные анаэробные бактерии ii 7,0. Рядом ученых изучалась амилаза культур В. В. x ,5, В. В. i 7, 8. Глюкоамилазасинтезируется в основном микроскопическими грибами рода i или i . Однако продуцентами глюкоамилазы являются и другие микроорганизмы, включая 1рибы i, , дрожжи 2, бактерии ii i , . Сарейкайте И. А. i, удельная активность которой в раз превышала удельную активность ранее известных глюкоамилаз и составила едмг при С 7. Из рода природными штаммами, утилизирующими крахмал, являются дрожжи . Продуценты фруктофуранозидазы. Наиболее широко изученной группой микроорганизмов в отношении фруктофуранозидазы являются дрожжи vii 7, 9, , 4, 9, 1, 0. Отмечен биосинтез фруктофуранозидазы также дрожжами . Алексанян . I., . Имеющиеся в литературе данные показывают, что наиболее активные продуценты фруктофуранозидазы встречаются среди грибов . Кирилловой Л. Сравнительно малоизученной группой микроорганизмов в отношении образования фруктофуранозидазы являются бактерии. Обнаружена фруктофуранозидаза у бактерий ii i 1, ii i 0, iii i 1, 4, v . Продуценты инулиназы. В настоящее время вопросы поиска эффективных продуцентов инулиназы и исследование физикохимических свойств фермента являются актуальными как за рубежом, так и у нас в стране. Микроорганизмы способны синтезировать эндо и экзоинулиназы. Первые расщепляют инулин с образованием преимущественно олигосахаридов и небольшого количества моно и дисахаридов, экзоинулиназы катализируют образование в основном моносахаридов 7, 7. Из литературных данных, особенно из обзоров Васильева Н. А. 5 и V Е. Микроорганизмы, синтезирующие инулиназу, представлены в табл. Как видно из таблицы, среди микроскопических грибов активными продуцентами инулиназ являются . Xi i и Xi 2, 3 проводили скриннинг 0 штаммов микроорганизмов, гидролизующих инулин до фруктозы. Наиболее активный продуцент инулиназы идентифицирован как i i. МТСС 0, продуцирующий активную термостабильную инулиназу. Таблица 1. Как отмечают . Активными и широко распространенными продуцентами инулиназ считаются также дрожжи . В литературе приводятся также данные о ряде микроорганизмовиродуцентов инулиназ, а именно i 0, 1, 0, ii i 4. Маркосян I. Корейскими авторами . Способность к биосинтезу инулиназы обнаружена у бактерий ii i и i ii 0 А 1, необходимых для промышленного производства глюкозофруктозного сиропа. А. исследовал биосинтез инулиназы бактериями 4. Дрожжи и бактерии образуют в основном внутриклеточную инулиназу, что осложняет технологию получения ферментных препаратов. Это связано с потерей активности на стадиях выделения фермента, необходимостью разрушения клеточной структуры, а также контролем активности инулиназы на стадии ее микробного биосинтеза. Продуценты галакгозидазы. Различные микроорганизмы активно синтезируют галактозидазу. Галакгозидазы микробного происхождения вызывают вс больший интерес изза возможности увеличения продуктивности продуцента за счет селекции и направленного биосинтеза, сравнительно невысокой их стоимости. Довольно полно изучена галактозидаза, бактерий рода ii 2, 3, i . Наиболее широко из перечисленных прокариотов исследована галактозидаза . Однако с практической точки зрения наибольший интерес представляют эукариоты, так как способность продуцировать экзогенную галактозидазу найдена только у микроскопических грибов . Это облегчает выделение фермента. Наибольший интерес представляют грибы продуценты галактозидазы vi ii и i i , дрожжевая культура .