Исследование синтетических пептидов-агонистов неопиоидного рецептора β-эндорфина

• Автор: Ковалицкая, Юлия Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Неопиоидное действие Рэндорфина

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Г лава 1. Материалы и методы

1. Реактивы.

2. Экспериментальные животные.

3. Штамм бактерий.

4. Клеточные линии
5. Среды для работы с культурами клеток.
6. Синтетические пептиды3
7. Методы выделения и оценки функциональной активности иммунекомпетентных клеток.
7.1. Получение макрофагов брюшной полости мыши.
7.2. Определение способности макрофагов к адгезии
7.3. Определение способности макрофагов к распластыванию
7.4. Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов i vi.
7.5. Культивирование лейкемических линий человека i vi
7.6. Оценка ростовой активности лейкемических клеток по включению метил Нтимидина в клетки
7.7. Изучение спонтанной миграции мышиной макрофагподобной линии iЗ из капли агарозы
8. Получение поликлональных антител к молекуле иммунорфина
8.1. Получение поликлональной сыворотки
8.2. Тестирование сывороток мышей на наличие антител к иммунорфину
в иммуноферментном анализ
9. Методы культивирования доимплантационных зародышей мыши i vi
. Определение кинетических характеристик взаимодействия изучаемых пептидов с рецепторами методом радиолигандного анализа
.1. Получение мембранных фракций из различных органов крысы.
.2. Иодирование пептида пентарфина.
.3. Получение 3Ниммунорфина
.4. Изучение связывания мечеиного пентарфина и 3Ниммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши, лейкимическими клетками и мембранными фракциями из различных органов крысы
.5. Анализ ингибирования связывания меченного пентарфина и 3Ниммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши, клетками линии и мембранными фракциями из органов крысы немечеными пептидами и налоксоном.
. Изучение функциональной активности надпочечников крысы.
.1. Изучение влияния иммунорфина на активность аденилатциклазы в мембранах коры надпочечников крысы.
.2. Исследование влияния иммунорфина на уровень оксикортикостероидов в надпочечниках и плазме крови крыс.
. Статистическая обработка результатов.
Глава 2. Результаты исследований.
1. Характеристика пептидов.
2. Влияние пептидов на функциональную активность перитонеальных макрофагов мыши i vi
2.1. Действие пептидов на спонтанную миграцию клеток мышиной макрофагподобной линии Vi3 из капли агарозы i vi.
2.2. Влияние пентарфина и циклопентарфина на адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов мыши i vi.
2.3. Влияние пентарфина и циклопентарфина на бактерицидную активность перитонеальных макрофагов.
3. Влияние пептидов на рост лейкемических клеточных линий человека i vi
3.1. Действие иммунорфина на рост Тлимфобластной клеточной линии человека
3.2. Влияние циклопентарфина на рост клеток острой промиелоцитарной лейкемии человека
4. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы
4.1. Влияние иммунорфина на аденилатциклазную активность мембран коры надпочечников крысы.
4.2. Влияние иммунорфина на уровень оксикортикостероидов в
надпочечниках и плазме крови крысы.
5. Влияние пептидов на развитие доимплантационных зародышей мыши
6. Изучение рецепции пептидов
6.1. Связывания 3Ниммунорфина с перитонеальными макрофагами мыши.
6.2. Связывания 3Ниммунорфина с клетками Тлимфобластной линии .
6.3. Связывание 3Ниммунорфина с мембранами выделенными из различных органов крысы
6.4. Связывания 3Ниммунорфина с мембранами коры надпочечников крысы
6.5. Изучение связывания 1 меченного пентарфина с перитонеальными макрофагами мыши.
7. Получение поликлональных мышиных антител к молекуле иммунорфина .
Глава 3. Обсуждение результатов.
3.1. Влияние иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на функциональную активность клеток иммунной системы.
3.2. Влияние иммунорфина на активность коры надпочечников крысы
3.3. Влияние пентарфина, циклопентарфина и циклодипентарфина на
развитие доимплантационных зародышей мыши.
3.4. Исследование неопиоидного рецептора рэндорфина с помощью Р
эндорфинподобных пептидов.
ЛИТЕРАТУРА
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ аденозинтрифосфат АКТГ адренокортикотропный гормон БСА бычий сывороточный альбумин ИФА иммуноферментный анализ кДа килодальтон
Кон А конканавалин А, лектин vi i
КС оксикортикостероиды
ЛПС бактериальный липополисахарид
Трис трис ги дроке и мети л аминометан
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
цАМФ циклический аденозинмонофосфат
цГМФ циклический гуанозинмонофосфат
ЦНС центральная нервная система
фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина , состоящий из доменов Сц2 и СцЗ от англ. i кристаллизующийся фрагмент Ы2гидроксиэтилпиперазинМ2этансульфоновая кислота I иммуноглобулин класса Н цепь v тяжелая цепь иммуноглобулина ПОМК проопиомеланокортин I интерлейкин
равновесная константа диссоциации
равновесная константа ингибировнаия
п число мест связывания рецепторов в расчете на одну клетку
полиэтиленгликоль сорбитанмонолаурат
фенилметилсульфопилфторид
Для написания последовательностей пептидов и белков были использованы однобуквенные и трехбуквенные символы аминокислот.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В настоящее время на основе производных природных пептидных гормонов уже создано и успешно применяется в клинике несколько десятков эффективных и безопасных лекарственных препаратов. Получение и изучение новых пептидов с простой структурой состоящих из нескольких аминокислотных остатков, высокой устойчивостью к действию протеаз долгоживущих и обладающих ценными фармакологическими свойствами важнейшая задача современной биохимии. В этой связи, изучение спектра биологической активности и механизма действия иммунорфина и его активных производных является актуальным исследованием, результаты которого могут быть использованы на практике при создании новых лекарственных препаратов. Цели н задачи исследовании. Цель настоящей работы изучение свойств и механизма действия синтетического Рэндорфинподобного пептида иммунорфина и его активных фрагментов и аналогов. Изучение влияния иммунорфина, пентарфина фрагмента иммунорфина 6 и циклоиентарфина на активность перитонеальных макрофагов мыши i vi. Исследование влияния иммунорфина на активность клеток коры надпочечников крысы i vi и i viv. Изучение влияния пентарфина, циклопентарфина и циклодипентарфина на доимплантационное развитие зародышей мыши i vi. Получение 3Ниммунорфина и ,1мсченного пентарфина и исследование их связывания с перитонеальными макрофагами мыши и мембранными фракциями, выделенными из различных органов крысы. Работа выполнена в лаборатории Пептидных биорегуляторов Филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН в соответствии с планом научноисследовательских работ. Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым эксперментальным доказательством того, что эндорфинподобный пептид иммунорфин, соответствующий аминокислотной последовательности тяжелой цепи I человека, является селективным агонистом неопиоидного не чувствительного к налоксону рецептора эндорфина. Впервые охарактеризовано распределение данного рецептора в организме крысы, и установлена его функция в клетках коры надпочечников. Приоритетными являются данные о стимулирующем действии иммунорфина, пентарфина и циклопентарфина на фагоцитоз перитонеальными макрофагами мыши вирулентного штамма ii 5 i vi. Впервые показано, что пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин стимулируют деление бластомеров и ускоряют развитие доимплантационных зародышей мыши i vi. Практическая ценность результатов работы. Ученые и клиницисты во всем мире рассматривают биологически активные пептиды как потенциальные лекарственные средства нового поколения. С этих позиций ценной может оказаться способность иммунорфина и его фрагментов стимулировать бактерицидную активность макрофагов вполне вероятно, что использование данных пептидов или их производных совместно с антибиотиками позволит снизить терапевтические дозы, а значит и многочисленные негативные последствия применения последних. Благодаря ярко выраженному положительному влиянию на доимплантационное развитие зародышей фрагменты иммунорфина пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин могут найти применение в экспериментальной эмбриологии в качестве средств повышения жизнеспособности ранних эмбрионов. Синтетические эндорфинподобные пептиды иммунорфин V, пентарфин V и циклопентарфин V активируют перитонеальные макрофаги мыши i vi стимулируют способность макрофагов к адгезии, распластыванию, миграции и увеличивают их бактерицидность при фагоцитозе бактерий вирулентного штамма ii 5. Иммунорфин ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию оксикортикостероидов из надпочечников в кровь. Пентарфин, циклопентарфин и циклодипентарфин VV увеличивают жизнеспособность, а также стимулируют деление бластомеров и образование нормальных бластоцист из доимплантационных зародышей мыши i vi. Ниммунорфин и 1меченный пентарфин с высоким сродством и специфичностью связываются с неопиоидным не чувствительным к опиоидному антагонисту налоксону рецептором эндорфина на перитонеальных макрофагах мыши, клетках человеческой Тлимфобластной линии , а также на мембранах коры надпочечников, миокарда, селезенки и головного мозга крысы.