Исследование функциональных свойств рековерина, содержащего реконструированный Ca2+ - связывающий центр EF4

• Автор: Ваганова, Светлана Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая схема зрительной трансдукции

1.1. Строение глаза, сетчатки и фоторецепторных клеток.

1.2. Морфология и состав наружных сегментов палочек.

1.3. Передача зрительного сигнала.

1.4. Восстановление темнового состояния фоторецепторной клетки. .

2. Рековерин

2.1. Тканевая и клеточная локализация.

2.2. Ген и первичная структура

2.3. Ыконцевое ацилирование

2.4. Са2связывающие центры рековерина
2.5. Са2зависимое взаимодействие рековерина с фоторецепторными мембранами
2.6. Ортологи и гомологи рековерина.
3. Родопсинкиназа.
3.1. Ген и тканевая локализация родопсинкиназы
3.2. Характеристика доменов родопсинкиназы и
посттрансляционные модификаци и.
3.3. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и ее активация. .
3.4. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой
3.5. Фосфорилирование родопсина с высоким выходом.
4. Рековерин как Са сенсор родопсинкиназы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы и реактивы.
2. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток
3. Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции.
4. Отбор мутантных клонов
5. Секвенирование ДНК
6. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соН
7. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутантных форм.
8. Приготовление кальциевых буферов и измерение Са2Ггее.
9. Определение количества кальция, связанного с рековерином
. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки
. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран
. Связывание рекомбинантного рековерина и его мутантных форм с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами.
. Выделение родопсинкиназы.
. Определение активности родопсинкиназы
. БРЯспектроскопия
.1. Приготовление и иммобилизация липосом
.2. Измерение связывания рековерина и его мутантных форм с БРЯчипом. Обработка экспериментальных данных
. Аналитические процедуры
.1. Определение концентрации белков
.2. БОБэлектрофорез в полиакриламидном геле.
.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Получение мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2связывающему центру ЕЕ4 и одновременно с нарушенной Са2связывающей способностью у ЕБ2 ЕЕ и
ЕБЗ ЕБ.
1.1. Клонирование мутантов рековерина ЕЕ4, ЕЕ и ЕЕ
1.2. Экспрессия мутантов рековерина ЕР4, ЕЕ и ЕЕ.
1.3. Выделение мутантов рековерина ЕБ4, ЕЕ и ЕЕ.
2. Связывание ионов кальция мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са2связывающему центру.
2.1. Мутант ЕЕ
2.2. Мутант ЕЕ
2.3. Мутант ЕЕ
3. Са2зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2связывающему центру, с фоторецепторными мембранами.
4. Са2зависимое ингибирование родопсинкиназы мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са2связывающему центру.
5. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом БРЯспектроскопии.
5.1. Принцип метода БРЯспектроскопии
5.2. Применимость метода БРЯспектроскопии для изучении взаимодействия мутанта рековерина ЕЕ4 с иммобилизованным липидным бислоем.
5.3. Изучение зависимости взаимодействия мутанта ЕЕ4 с липидным бислоем, иммобилизованным на БРЯчипе, от концентрации ионов кальция и белка.
5.4. Кинетика диссоциации мутантов ЕЕ4, ЕЕ и ЕЕ из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на БРЯчипе. .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кроме того, эволюционное совершенствование зрительного аппарата привело к более плотной упаковке зрительных фоторецепторных клеток в светочувствительном слое, что также улучшило качество изображения развилась вращательная способность глаза, позволившая быстро находить и удерживать в поле зрения объект наблюдения образовался зрачок подвижная диафрагма, регулирующая количество поступающего внутрь света появились веки, защищающие глаз от повреждения и высыхания. В итоге сформировался сложно устроенный и совершенный зрительный орган человека рис. Рис. Строение зрительного органа человека. Глазное яблоко имеет неправильную шаровидную форму спереди выпуклость сильнее выражена. Линия, соединяющая передний и задний полюсы глаза, называется осью глаза и соответствует его максимальному размеру у человека в среднем мм. В глазном яблоке выделяют две основные составляющие ядро и капсулу. Ядро глазного яблока включает хрусталик, водянистую влагу и стекловидное тело, которые прозрачны и в большей или меньшей степени способны преломлять свет. Хрусталик имеет вид двояковыпуклой линзы с большей кривизной задней поверхности. Вещество хрусталика, прозрачное и бесцветное, не содержит сосудов и нервов, снаружи оно облечено в бесструктурную прозрачную капсулу. В процессе дифференцировки эпителиальные клетки хрусталика утратили свои органеллы и сохранили лишь некоторые продольно расположенные микротрубочки и скопления свободных рибосом. Волокна хрусталика построены из характерного для них белка кристаллина. Водянистая влага представляет собой текучую прозрачную жидкость, близкую по своему составу плазме крови и содержащую некоторое количество гиалуроновой кислоты. Она заполняет пространство, примыкающее к передней полусфере хрусталика, тогда как задняя его поверхность соприкасается со стекловидным телом. Стекловидное тело, на которое приходится основная масса глазного яблока, облечено в прозрачную бесструктурную оболочку и большей частью своей поверхности прилегает к сетчатке. Оно представляет собой прозрачное и аморфное вещество, состоящее из белка витреина и гиалуроновой кислоты. Капсула глазного яблока стенка глаза включает в себя три слоя, по медицинской номенклатуре оболочки. Это в направлении от периферии к центру глаза наружный опорный, средний увеальный и внутренний сетчатый слои глазной капсулы 1. Опорный слой охватывает глаз снаружи и состоит из двух отделов, склеры и роговицы, практически полностью облегающих глазное яблоко первая сзади, вторая спереди, за исключением тех мест, где склеру пронизывают кровеносные сосуды и зрительный нерв. Склера, или белочная оболочка, окрашена в белый цвет, непрозрачна, кровеносных сосудов имеет мало то, что обычно называют белком глаза, и есть видимая снаружи часть склеры. Спереди склера резко меняет свою структуру и свойства и непосредственно переходит в роговицу, которая покрывает центральный участок глаза с его фронтальной стороны. Роговица, прозрачная и заметно выпуклая, состоит из плотной соединительной ткани и лишена кровеносных сосудов. Увеальный слой богат пигментом и кровеносными сосудами, благодаря чему его также называют сосудистой оболочкой глаза. Этот слой в двух задних третях глаза представлен тонкой, имеющей бурый цвет собственно сосудистой оболочкой, которая сзади пронизана отверстием для зрительного нерва. Ближе к передней части глаза увеа утолщается, образуя так называемое цилиарное ресничное тело, расположенное в виде кольца в области перехода склеры в роговицу. Продолжаясь вперед, цилиарное тело переходит в радужную оболочку, которая имеет форму фронтально поставленного диска с центральным отверстием, известным как зрачок. Диаметр зрачка изменяется в пределах мм с помощью мышц, заложенных в соединительнотканной основе радужки. Окраска радужки может варьировать в зависимости от количества присутствующего в ней пигмента от светлосерой и светлоголубой до темнокоричневой и почти черной. У альбиносов пигмент нацело отсутствует, так что радужка у них имеет красный цвет благодаря обилию кровеносных сосудов.