Использование протопластов для изучения метаболизма древоразрушающих грибов

• Автор: Зверева, Елена Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БИОСИНТЕЗ И РАЗЛОЖЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ КАК НАИБОЛЕЕ МАСШТАБНЫЕ ПРОЦЕССЫ КРУГОВОРОТА УГЛЕРОДА

1.1. Структура целлюлозы

1.2. Структура лигнина

1.3. Ферменты целлюлазного комплекса

1.4. Лигнинразрушающие ферменты

1.4.1. Ферменты возбудителей мягкой гнили

1.4.2. Ферменты возбудителей белой гнили

ГЛАВА 2. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И ЕГО РОЛЬ В РЕАКЦИЯХ РАЗЛОЖЕНИЯ ЛИГНИНА. МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ ГРИБОВ ОТ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА
2.1. Активные кислородные метаболиты АКМ
2.1.1. Строение и свойства основных АКМ
2.1.2. Механизмы повреждающего действия АКМ
2.2. Защита от повреждающего действия АКМ
2.2.1. Антиоксидантная защита грибов
2.2.2. Защита от АКМ с помощью низкомолекулярных соединений
2.3. Роль окислительного стресса в нормальном функционировании
организма
2.3.1. Роль АКМ в процессе разложения лигнина
ГЛАВА 3. РАСПРОСТРАНЕНИЕ, КЛАССИФИКАЦИЯ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ рГЛЮКОЗИДАЗ
3.1. Рглюкозидазы растений
3.2. Рглюкозидазы грибов
3.3. Физикохимические свойства и механизм действия рглюкозидаз
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Исходные вещества
4.2. Условия культивирования штаммов
4.3. Методика получения протопластов
4.4. Определение степени регенерации и реверсии протопластов
4.5. Получение ауксотрофных мутантов гифомицета i ii
4.6. Аналитические методы
4.7. Методы определения активностей ферментов
4.8. Определение антиоксидантной активности мицелиальных экстрактов
4.9. Изучение влияния антиоксидантов на регенерацию и реверсию протопластов
4 Исследование продуктов трансгликозилирования
4 Изоэлектрофокусирование экстракта мицелия i i 6
4 Получение упаренных экстрактов Т.i 6
РЕЗУЛЬТАТЫ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И РЕГЕНЕРАЦИЯ ПРОТОПЛАСТОВ ГРИБОВ
5.1. Получение протопластов базидиальных грибов
5.2. Получение протопластов гифомицетов
5.3. Регенерация и реверсия протопластов
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРОТОПЛАСТИРОВАНИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ НА БИОСИНТЕТИЧЕСКУЮ СПОСОБНОСТЬ И АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ГИФОМИЦЕТОВ
ГЛАВА 7. ТРАНСФЕРАЗНАЯ И ГИДРОЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ СВЯЗАННЫХ С КЛЕТКОЙ рГЛЮКОЗИДАЗ
7.1. Распределение связанных с клеткой рглюкозидаз в спорах,
протопластах и мицелии i i 6
7.2. Трансферазная активность рглюкозидаз, как возможное объяснение эффекта ингибирования избытком субстрата
7.3. Характер продуктов,образуемых внутриклеточной рглюкозидазой ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Показано, что в регенерантах первого поколения наблюдается увеличение эндоглюканазной и Рглюкозидазной активностей что, очевидно, является реакцией на стресс, однако оно не закрепляется в последующих поколениях. Показано, что повышение жизнеспособности протопластов может быть достигнуто путем введения в среды для протопластирования иили регенерации соединений с антиоксидантной активностью. Показан различный характер рНзависимостей рглюкозидаз спор, мицелия и протопластов грибов, их ингибирования избытком субстрата. Установлено наличие метаболитов арилгликозидного характера, свидетельствующих о протекании реакций трансгликозилирования с участием связанной с клетками Рглюкозидазы. Практическая значимость работы. Результаты диссертации могут быть использованы для разработки методов генетической трансформации гифомицетов и базидиомицетов и повышения уровня синтеза целлюлаз. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано и принято к публикации 7 печатных работ. Целлюлоза, гемицеллюлозы и лигнин основные структурные компоненты клеточной стенки. Они представляют собой наиболее распространенные на Земле органические соединения, запасы которых постоянно восполняются в результате фотосинтеза. Поэтому их можно рассматривать как неиссякаемые источники различных химических соединений и энергии. Рассмотрим подробнее строение целлюлозы и лигнина. ГЛАВА 1. Целлюлоза самый распространенный в природе возобновляемый органический полимер, скорость синтеза которого оценивается как 4x тонн ежегодно i . Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид, состоящий из ангидроглюкопиранозных звеньев, соединенных 14рглюкозидными связями. Элементарное звено ангидроглюкозный остаток имеет в ней так называемую конформацию кресла, при которой атомы С2, СЗ, С5 и лежат в одной плоскости, а атомы С1 и С4 по разные стороны от нее. При этом все объемные заместители могут занимать либо экваториальное наиболее выгодное положение, либо располагаться аксиально, то есть над и под указанной плоскостью. В наиболее устойчивой конформации 4С1 глюкогшранозного кольца первичный и вторичные гидроксилы расположены экваториально. Остаток глюкозы может принимать также менее энергетически выгодные конформации. Каждая из них имеет ряд устойчивых позиционных изомеров, отличающихся положением объемных заместителей Рабинович с соавт. В глюкозном остатке принято выделять гидрофильную и гидрофобную плоскости в зависимости от того, сколько ОН и СНгрулп ей соответствуют. Это разделение особенно важно при изучении взаимодействия глюкозного остатка с остатками ароматических аминокислот при ферментативном расщеплении молекулы целлюлозы в активном центре фермента. В строгом смысле мономером целлюлозы является не глюкозное, а дисахаридное целлобиозное звено, имеющее в макромолекуле длину 1. Гибкость молекулы целлюлозы определяется возможностью вращения ангидроглюкозных остатков в целлобиозном звене относительно рГЛИКОЗИДНОЙ связи, что выражается в изменении углов, характеризующих вращение вокруг связей с участием гликозидного кислорода С1 и С4, а также угла, характеризующего поворот полимерной цепи вокруг оси, проходящей через гликозидные кислороды. Устойчивость линейной конформации целлюлозы определяется, в частности, минимальным отталкиванием С1Н и С4Н соседнего глюкозного звена. В молекуле целлюлозы выделяют восстанавливающий конец остаток глюкозы, полуацетальный гидроксил С1атома которого не вовлечен в гликозидную связь. Соответственно, невосстанавливающий конец ангидроглюкозный остаток, у которого свободен экваториальный гидроксил при С4атоме. Направление молекулы считают от невосстанавливающего к восстанавливающему концу. Важной характеристикой целлюлозных макромолекул является степень полимеризации. Природная целлюлоза является полидисперсной, то есть состоит из молекул разной длины, поэтому степень полимеризации является усредненным показателем Рабинович с соавт. Очевидно, что такая длинная, регулярно построенная молекула определенным образом уложена. Эта укладка определяет надмолекулярную структуру полимера конформацию и расположение повторяющихся единиц относительно друг друга.