Исследование транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма

• Автор: Блашко, Эдуард Львович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные исследования транспорта гомоцистеина в крови в условиях оксидативного стресса, характерного для гипергомоцистеинемии

1.2. Исследование эндотоксического действия гомоцистеина

1.3. Основные сведения о современных методах определения гомоцистеина

Глава 2. Методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы анализа гомоцистеина

2.2.1. Метод ВЭЖХ анализа гомоцистеина со спектрофотометрическим детектированием

2.2.2. Количественное определение соотношения общего и восстановленной формы Гци в плазме крови пациентов с различной патологией

2.3. Методы биохимического мониторинга эффектов повышения концентрации гомоцистеина

2.3.1. Определение ТБК активных продуктов, включая малоновый диальдегид в плазме крови
2.3.2. Определение вН групп
2.4. Моделирование акселерации токсических эффектов на фоне гипергомоцистеинемии различного уровня введением экспериментальным крысам гомоцистина и его смеси с аргинином
2.5. Получение очищенных препаратов и анализ содержания альфа2макроглобулина
2.5.1. Количественное определение альфа2макроглобулина
2.5.2. Очистка альфа2макроглобулина и приготовление образцов, активированных трипсином.
2.6. Изучение распределения гомоцистеина во фракциях плазмы крови здоровых доноров и у пациентов с различной степенью гипергомоцистеинемии методом гель фильтрации
2.7.Изучение гидрофобной сорбции гомоцистеина крупно молекулярными фракциями плазмы крови
2.8. Изучение связывания гомоцистеина очищенными препаратами альфа2макроглобулина, активированными и неактивированными трипсином.
2.9. Вспомогательные общепринятые методики
3.0. Математический анализ и статистическая обработка полученных данных
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
Изучение свойств аминотиолов и их производных.
3.1. Абсорбционные спектры производных аминотиолов
3.2. Оптимизация высвобождения гомоцистеина из дисульфидных форм
3.3. Усовершенствование процедуры калибровки анализа
3.4. Селективность анализа гомоцистеина по отношению к глутатиону при использовании колонок с обращенно фазными сорбентами типа С8 и С
3.5. Серийный анализ плазмы крови
3.6. Исследование эндотоксического действия гомоцистина окисленного гомоцистеина при состояниях оксидативного стресса
3.6.1. Моделирование акселерации токсических эффектов на фоне гипергомоцистеинемии различного уровня введением экспериментальным крысам гомоцистина и смеси гомоцистина с аргинином
3.6.2. Измерение уровня тиоловых групп и продукта перекисного окисления липидов малонового альдегида у пациентов с гипергомоцистеинемиями дд
3.7. Определение соотношения общего гомоцистеина и его восстановленной формы в образцах плазмы крови больных
3.8. Изучение связывания гомоцистеина активированным альфа2макроглобулином
3.8.1. Изучение распределения гомоцистеина при гель фильтрации плазмы крови у здоровых доноров и у пациентов с различной степенью гипергомоцистеинемии
3.8.2. Изучение гидрофобной сорбции гомоцистеина крупномолекулярными фракциями плазмы крови
3.8.3. Изучение связывания гомоцистеина очищенными препаратами альфа2макроглобулина, активированными и неактивированными трипсином
Заключение Выводы Литература
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АФК активные формы кислорода термин шире, чем СР, т.к. включает кроме радикалов, перекись водорода, синглетный кислород, гипохлориты, гидроперекиси ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография ГГТ гаммаглутамилтрансфераза КФ 2.3.2.
Глт глутатион в свободной восстановленной или окисленной форме, в том числе в виде смешанного дисульфида
Гци гомоцистеин в свободной восстановленной или окисленной форме, в том числе в виде смешанного дисульфида
оГци общий гомоцистеин плазмы крови, выявляемый в анализе после восстановления всех форм Гци вГци восстановленный гомоцистеин ГГци гипергомоцистеинемия
ДТНБ 5,5дитиобис2нитробензойная кислота, реактив Эллмана
ДТТ дитиотреитол
МГ, а2М альфа2макроглобулин
МДА малоновый диальдегид
супероксиданион
ПОЛ лерекисное окисление липидов
СОД супероксиддисмутаза КФ .
СР свободно радикальное окисление
ТБК тиобарбитуровая кислота
ТИБ производные тионитробензоатные производные
Ключевые слова гомоцистеин, глутатион, дитиотреитол, супероксиданион, ВЭЖХ анализ, альфа2макроглобулин, эндотелиальные дисфункции, оксидативный стресс.
Введение


Супероксиданион, в свою очередь, непосредственно участвует в реакциях перекисного окисления липидов и образования пероксинитрита в случае конъюгации с оксидом азота ,. Вклад других белков, помимо альбумина, в транспорт Гци изучен, к настоящему времени недостаточно. Актуальность этой проблемы велика в связи с тем, что при рецепторном эндоцитозе белков, связанный с ними Гци, может возвращаться в некоторые клетки. ГГци. Имеются портативные специализированные ВЭЖХ анализаторы оГци, такие как система для определения Гци ОЭЗОНсу с флуориметрическим детектированием продукта модификации Гци. В связи с изучением транспортных форм Гци в плазме крови, его влиянием на окислительно восстановительные равновесия других аминотиолов, участием в генерации супероксиданиона, ковалентных модификациях нативных белков, а также использованием в качестве диагностического маркера, разработка и совершенствование методов анализа оГци приобрели актуальность не только для развития фундаментальной биохимии, но и имеют большое практическое значение при реализации программ охраны здоровья населения 5. Надо заметить, что очень важно выявлять отклонения по содержанию оГци в плазме крови человека как можно раньше, так как его повышение на 5 мкМ приводит к повышению риска тромбозов, аналогично повышению уровня холестерина на 0,5 мМ . Для получения модифицированных производных Гци с целью его количественного определения как аминокислоты можно использовать флуоресцентную метку по функциональной аминогруппе ортофталевым альдегидом ,,,,0,2. Эти исследования впервые позволили установить повышенный уровень оГци у жителей нашего региона. Модификация Гци другими агентами по тиоловой группе, наряду с оГци, позволяет определять соотношение общего гомоцистеина и его восстановленной формы вГци. Для такого приготовления хромофорных аддуктов могут использоваться различные химические агенты. Одни позволяют работать с флуоресцирующими модификатами, другие выявлять продукты спектрофотометрическим методом детектирования в ходе хроматографического анализа ДТНБ реактив Эллмана . Ключевой проблемой всех видов анализа оГци является воспроизводимый и исчерпывающий перевод различных форм гомоцистеина, имеющихся в плазме крови и других образцах тканей, в одну регистрируемую производную форму ,1. В данной области аналитических исследований до настоящего времени продолжается усовершенствование и модификация методов выявления оГци, это явилось одной из первоочередных задач настоящего исследования. Цель исследования заключалась в развитии представлений о транспортных формах гомоцистеина в плазме крови с использованием современного высокочувствительного экспресс метода ВЭЖХ анализа оГци а также в изучении некоторых показателей оксидативного стресса при ГГци различных степеней. Изучить параметры хроматографического разделения хромогенных производных аминотиолов глутатиона, гомоцистеина и пеницилламина с использованием колонок обращеннофазных сорбентов С8 и С. Изучить УФ спектры поглощения ТНБ производных различных аминотиолов и зависимость абсорбции света в области максимума поглощения для производных гомоцистеина, глутатиона и пеницилламина при различных концентрациях. Выявить оптимальные параметры температурной обработки при высвобождении гомоцистеина из связанных дисульфидных форм. Для моделирования связанного состояния гомоцистеина в плазме крови изучить возможность использования раствора альбумина в качестве белка со свободной тиоловой группировкой. Оптимизировать условия подготовки экспериментальных образцов плазмы крови, при которых Гци претерпевает полную модификацию, сопоставимую с таковой для Глт, изучить воспроизводимость исчерпывающего перевода различных форм Гци, имеющихся в плазме крови, в одну регистрируемую производную форму. Исследовать связывание гомоцистеина с фракциями белков крови методом гель фильтрации у здоровых доноров и у пациентов с гипергомоцистеинемией. Методом гель фильтрации изучить транспорт гомоцистеина белками плазмы крови при умеренных и промежуточных формах гипергомоцистеинемии от до 0 мкМ.